犬腺病毒2型抗原的制备及间接ELISA的建立

用MDCK细胞增殖犬腺病毒2型弱毒疫苗株,病毒培养上清液经差速离心和酒石酸钾密度梯度离心浓缩、纯化后作为诊断抗原,建立了犬腺病毒2型抗体检测的间接ELISA。确定最佳抗原包被量为0.168μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,作用时间为60 min,羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1:2000,作用时间为60 min,底物作用时间为37℃,10 min。判定标准为S/P值≥0.351者判为阳性,S/P值≤0.318者判为阴性。该抗原不与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬波特氏杆菌等3种犬常见传染病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内、批间重复试验,变异系数小于15%,显示具有较好的重复性;检测血清样品56份,与病毒中和试验结果比对的符合率为93.75%。本研究结果为实现犬腺病毒感染监测,进行犬腺病毒流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

柠檬黄的ELISA检测方法的建立

利用免疫学基本原理，获取抗柠檬黄的单克隆抗体，以此建立了从食品中检测柠檬黄的间接竞争ELISA．试验表明：OVA—TE最适包被浓度为1μg／mL；酶标抗体最适工作浓度为1：3000；酶标抗体的作用温度和时间分别为37℃，lh；封闭液为1％明胶；底物显色时间为15min；对柠檬黄的最低检出量为26．34ng／mL；抗体的最适稀释倍数为1：12000倍；对该方法进行交叉性试验和重复性试验，结果表明此法是一种特异、灵敏、快速的检测方法，并适合大批量样品检测．     

布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。     

基于pgk蛋白的犬嗜血支原体ELISA诊断方法的建立（英文）

为了开发一种准确、快速的检测犬嗜血支原体的方法,建立了一种基于犬嗜血支原体磷酸甘油酸激酶(PGK)的间接ELISA方法 .从已发表的NCBI犬嗜血支原体全基因组序列库中获得了其磷酸甘油酸激酶(PGK)基因序列.通过选择原核生物首选的密码子优化基因序列,将化学合成的新基因序列pgk插入质粒中,成功构建了原核表达载体pet32a(+)-pgk,并在大肠杆菌BL21中表达.经SDS-PAGE证实,该蛋白的相对分子量约为60 ku.以纯化的PGK重组蛋白作为抗原进行包被,建立了基于PGK蛋白的间接ELISA方法,并进一步对条件进行优化.结果表明,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1∶200,封闭剂的最佳工作浓度为5%脱脂乳,最佳封闭时间为45 min,待检血清的最佳作用时间为60 min,酶标二抗的最佳工作浓度为1∶5 000,酶标二抗的最佳作用时间为30 min.基于以上,建立了一种检测犬嗜血支原体的间接ELISA方法,并选择临床阴性血清计算其临界值.采用该方法检测166份临床样本,阳性率为21.1%,与荧光定量PCR检测结果一致.本研究为犬嗜血支原体的临床监测提供了...     

软骨藻酸多克隆抗体的制备及间接竞争ELISA检测法的建立

软骨藻酸(Domoic Acid,DA)是记忆缺失性贝毒(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)的主要成分,能在鱼类、贝类富集,通过食物链的传递作用对人产生毒性作用.DA是小分子半抗原,运用活泼酯法将DA与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)提高偶联效率,通过紫外-可见分光光度法和聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)检测鉴定,成功制备偶联比为44∶1的完全免疫抗原DA-KLH和偶联比为16∶1的包被抗原DA-BSA;用DA-KLH免疫小鼠后获得高达210 000 units/m L效价的抗血清,并通过不断优化间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测DA的条件,确定各项最佳工作质量浓度及条件,最后成功绘制100 ng/m L～10μg/m L范围内的DA检测标准曲线.通过优化ic-ELISA检测方法成功实现了快速定量检测DA,这对水产品藻毒素检测试剂盒的开发具有指导意义,也为建立赤潮毒素监督体系提供了良好的实验基础.     

SARS病毒的S1蛋白基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

为了建立方便、敏感和特异的SARS病毒血清学诊断方法,利用PCR扩增,克隆了SARS冠状病毒S蛋白基因中从第68～918位碱基的基因序列(S1蛋白).并通过pGEX-4T1表达系统在大肠杆菌BL21中高效表达了SARS病毒S1蛋白,用超声波破碎菌体及用不同浓度的尿素洗涤包涵体,纯化了S1蛋白,纯度可达75%以上.以在E.coli高效表达的S1蛋白为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG为二抗,建立了检测SARS抗体的间接ELISA方法.经检测,筛选出最佳反应条件为5μg/孔.用纯化的E.coli表达的抗原包被酶标板,用5 g/L的小牛血清进行封闭,以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清.实验表明,应用表达的蛋白作为诊断SARS抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点.     

黄曲霉素M1间接竞争ELISA的建立及其在牛奶中的应用

利用高特异性单克隆抗体,建立黄曲霉素M1的间接竞争ELISA检测方法。棋盘法优化了包被抗原及酶标抗体的最佳稀释倍数。包被抗原和酶标抗体的最佳工作浓度分别为1∶15000和1∶2000。该方法的线性范围为(0.1—8.1)ng·mL-1。除了与黄曲霉素B1的交叉反应为35%外,与黄曲霉素B2、黄曲霉素G1及黄曲霉素G2的交叉反应均小于1%。在牛奶实际样品检测的回收率均大于70%,而且检测过程在10min以内即可完成。该方法灵敏度高,特异性强,而且操作简单,适合多样本的快速筛查,为黄曲霉素M1的高效检测提供了一个良好的选择。     

双抗体夹心ELISA检测禽流感病毒方法的初步建立

用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒(AIV)抗原的双抗体夹心ELISA方法. 经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件为:兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1: 8 000(浓度为3.531 ug/mL),抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1: 800,酶标二抗的工作浓度为1: 4 000. 与其他禽易感病毒(NDV、IBV、EDS-76V)等均没有交叉反应. 结果表明,本方法具有很高的特异性.     

猴腺病毒Ⅰ型间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用*

摘要: 目的建立检测血清中猴腺病毒Ⅰ型( SAdV-1) 抗体的间接免疫荧光方法( IFA) ,为检测实验猴群中SAdV-1 的感染情况提供参考依据。方法用SAdV-1 病毒感染BSC-1 细胞,待50% 细胞出现病变时,用胰蛋白酶消化以 20μL 1 × 107 个/mL 浓度的细胞液滴到24 孔镀膜玻片上,丙酮固定。利用制备的抗原片通过浓度滴定确定猴血清、 羊抗猴二抗最佳工作条件。对IFA 进行特异性、敏感性、重复性验证并初步检测猴血清样本。结果建立了SAdV- 1 抗体的间接免疫荧光检测方法。在采集的21 份猴血清样本中,检出SAdV-1 抗体阳性9 例,12 例血清检测为阴 性。结论方法具有良好的特异性和稳定性,可作为SAdV-1 检测的可靠方法。     

新基因BP1抗体制备及其在乳腺癌表达的初步观察

为了探讨新同源盒基因BP 1在乳腺癌的表达,运用生物信息学方法设计19肽,合成并偶联到大分子载体KLH上制成人工免疫原,制备兔抗BP 1多克隆抗体IgG.蛋白印迹方法检测BP 1在乳腺癌细胞系M CF 7、M DA-M B-231细胞均有表达:免疫组织化学结果显示,BP 1蛋白在乳腺癌的表达率显著高于癌旁组织,在雌激素受体阴性肿瘤的表达率高于雌激素受体阳性组。BP 1基因的异常表达参与了乳腺癌的发生,是一种新的乳腺癌分子标志物.     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32基因的克隆和表达及其在ELISA检测中的应用

钩端螺旋体 (钩体 )病是一种全球性的人兽共患病。人类感染钩端螺旋体后表现出多种器官和系统病变 ,愈后不良 ;也可垂直传播感染胎儿 ,引起流产。动物中 ,犬钩端螺旋体的感染率较高 ,感染后 ,临床表现多样 ,大多呈隐性感染 ,不发病 ,但钩体在肾脏中长期存在 ,持续随尿液向外排菌。由于钩端螺旋体对人的强致病性 ,以及由动物传播给人引起的严重公共卫生问题 ,因此快速准确地进行钩端螺旋体病的诊断 ,显得尤为重要 ,也是目前钩端螺旋体研究中亟待解决的问题。钩端螺旋体属钩端螺旋体科 ,钩端螺旋体属问号状钩端螺旋体种的成员。目前发现血清型…     

WSSV单抗的制备及其在红螯螯虾病毒病检测中的应用

将提纯的感染红螯螯虾的WSSV,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后取其脾细胞与SP2/0融合.间接ELISA筛选,阳性克隆经3次亚克隆后,共获得7株针对WSSV的特异性单抗,分别命名为E2、C2、E3、G3、C4、D5以及F10.细胞上清ELISA效价为1：1 600～1∶6 400.抗体亚类鉴定结果表明:E2、G3、C4属于IgG1,C2、D5、F10属于IgG3,E3属于IgG2a亚类;单抗热稳定性试验表明7株单抗均是热稳定的.选取单抗G3和F10进行病毒中和试验,结果表明:在适宜的抗原浓度下,两株单抗均有较好的中和能力.选取单抗G3作为一抗建立了间接ELISA方法,通过对人工感染红螯螯虾WSSV的测定,初步证实该单抗可用于WSSV的检测.     

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

通过电击转化法，将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中，经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光，表明gfp加基因得到稳定、高效的表达．进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明，转化菌株与原始菌株是一致的．该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段．     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B功能域及其全酶的原核表达及活性比较

通过设计引物,利用RT-PCR从人肝癌细胞(huh-7)中克隆蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)全长及功能域PTPc的cDNA序列并连接到pGEM-T Vector载体上,测序正确的cDNA序列连接到表达载体pET-32a(+)上,分别在大肠杆菌Transetta(DE3)和BL21(DE3)菌株中稳定表达目标蛋白,经Ni 2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯,通过酶促动力学方法分析两种蛋白的体外活性.本实验成功表达了PTP1B和PTPc可溶性蛋白,并发现Transetta(DE3)菌株较BL21(DE3)有更高的蛋白表达能力;酶促动力学分析表明,PTP1B全酶的Vmax为16.13mmol·L-1·s-1,Km为0.94mmol/L;其功能域PTPc的Vmax为5.49mmol·L-1·s-1,Km为0.54mmol/L.表明PTP1B全酶的活性高于PTPc功能域的活性.