汉滩病毒S基因0.7kb片段与M基因G2片段不同拼接方式嵌合基因原核表达产物的初步比较

比较汉滩病毒S、M基因部分片段的嵌合基因不同拼接方式表达产物的活性。构建了嵌合基因原核表达载体pGEX-4T-1-S0.7G2,并与已构建的pGEX-4T-1-G2S0.7的诱导表达产物进行了比较。结果表明,融合蛋白同时保持亲本蛋白的结合活性,且前者表达产物的结合活性始终比后者低。研究表明,嵌合基因的不同拼接方式对融合蛋白的活性可能有一定的影响。     

大肠杆菌中融合表达汉滩病毒S,M基因片段的研究

为在大肠杆菌中融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP含主要抗原位点的片段 .将汉滩病毒 76 118株S基因编码区 5′端约 0 .7kb的片段与M基因编码G1的片段连接 ,克隆入 pGEX 4T2 ,构建嵌合基因原核表达载体 pGEX 4T2 S 0 .7G1,在大肠杆菌XL1 Blue中诱导GST S0 .7G1融合蛋白的表达 .表达产物用ELISA和Westernblot进行鉴定 .限制性内切酶酶切鉴定证明 ,成功构建了嵌合原核表达载体 pGEX 4T2 S0 .7G1.经IPTG诱导后 ,ELISA活性测定结果表明 ,该融合蛋白可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合 .Westernblot结果显示 ,诱导出相对分子质量 (Mr)大于 1× 10 5的S0 .7G1与GST的融合蛋白 ,并有一系列大小不等的可与抗汉坦病毒NPmAb特异性结合的蛋白带 .获得具有特异性结合活性的融合蛋白GST S0 .7G1,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段的原核表达

取淋巴囊肿病病毒感染牙鲆组织,蛋白酶K裂解,PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3 kb基因片段.构建其原核表达载体,IPTG诱导表达.结果表明,该融合蛋白分子量约70 kD,可与抗LCDV多克隆血清特异反应.为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础.     

汉滩病毒嵌合基因G2S0.7重组腺病毒免疫学特性研究

对汉滩病毒糖蛋白 (GP)和核蛋白 (NP)的嵌合基因G2S0 .7重组腺病毒的免疫学特性进行研究。将汉滩病毒含有G2S0 .7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠 ,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果 ,以研究嵌合基因的免疫效果。结果用该重组腺病毒免疫的小鼠 ,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体 ,抗体效价分别为 1 :1 6 0及 1 :2 0。同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应。说明汉滩病毒嵌合基因G2S0 .7重组腺病毒 ,既可刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答 ,也可刺激机体产生特异性的细胞免疫应答 ,本研究为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了实验基础     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

拟南芥NOA1蛋白的原核表达和分析

通过构建AtNOA1的GST融合表达载体,在E.coli中表达AtNOA1蛋白,并分析不同诱导条件对AtNOA1蛋白表达的影响.结果表明,22℃是AtNOA1表达的最适诱导温度,而IPTG浓度在一定条件下变化对AtNOA1表达量无明显影响.     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板, 运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDV P20及P14基因, 并将其插入到pET-28a原核表达载体, 构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3) 宿主菌中, IPTG诱导表达, 经SDS-PAGE检测, pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白, pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白, 结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达, 表达出的蛋白大小与预期结果相符.     

汉滩病毒嵌合基因 G150.7 重组腺病毒免疫学特性研究

对本室已构建的汉滩病毒糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的嵌合基因GlS0.7重组腺病毒的免疫学特性进行研究.将汉滩病毒含有G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒直接免疫Balb/c小鼠,用ELISA、微量细胞培养中和实验及淋巴细胞增殖实验检测小鼠的免疫应答效果.用该重组腺病毒免疫的小鼠,可诱导产生抗汉滩病毒NP及GP特异性的抗体,抗体效价分别为1:320及1:40.同时重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体和明确的淋巴细胞增殖反应.说明所构建的汉滩病毒嵌合基因G150.7重组腺病毒,可同时刺激机体产生特异性的抗汉滩病毒体液免疫应答及细胞免疫应答.     

柑橘衰退病毒柠檬分离物外壳蛋白基因原核表达及多抗血清制备

在云南发现的柑橘衰退病毒柠檬分离物对云南省德宏州的柠檬产业造成较大危害.通过用NdeⅠ和XhoⅠ对柑橘衰退病毒柠檬分离物外壳蛋白基因进行双酶切,定向插入到表达载体pET-28a中,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG在28℃下诱导6 h后,SDS-PAGE电泳显示,在25 kDa处有特异表达谱带,回收特异蛋白带作为抗原免疫家兔,制备出特异抗血清.间接ELISA测得效价为1∶3000,并且与CTV具有良好的特异性反应.     

汉坦病毒CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的：构建含汉坦病毒M基因（编码糖蛋白G1）和部分S基因（编码核蛋白主要抗原区段）以及S基因的多个 CTL表位的多种重组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究。方法：构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对其表达产物进行鉴定。利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/C小鼠,通过多种免疫学方法检测其免疫反应。结果：成功表达出可被汉坦病毒核蛋白特异性单抗(mAb)及糖蛋白G1 的特异性单抗所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效刺激针对汉坦病毒NP及GP的免疫应答;同时结果表明在CTL多表位间加入间隔序列AAY的重组腺病毒免疫小鼠能产生更高的细胞免疫应答。结论： 构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力。间隔序列AAY对于各CTL表位的分隔有效地提高了重组腺病毒的免疫效果。     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。     

AtGT-3b基因克隆及原核表达与纯化

GT-3b转录因子是一个受NaCl和病原体诱导表达的GT-1-like转录因子,它能与GT-1 cis-element( GAAAAA)相互作用,促进下游基因的表达,在植物耐盐中起着重要的调节作用.通过分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGT-3b基因,克隆到原核表达载体pCold TF中,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行融合表达;通过纯化得到AtGT-3b融合蛋白,以期用于研究其与GT-1顺式作用元件在体外的相互作用.     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

Cloning, sequencing and expression of the coat protein gene of Cocksfoot mottle virus

The coat protein (CP) gene of Cocksfoot mottle virus (CfMV) was amplified by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-4T-1, and the resulting plasmid was designated as pGEXCfMV-JANCP. The fusion protein GST-CP was expressed in BL21 (DE3) pLysS after IPTG induction. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the CfMV-CP gene was efficiently expressed in E.coli BL21 (DE3) pLysS through IPTG induction and the 56.0 kD protein was obtained.