转ChIFN-γ基因烟草抗虫作用初步研究

 对田间烟蚜的自然发生情况观察和抗虫试验的研究显示,转ChIFN-γ基因烟叶具有显著的抗虫效果.为探索转基因烟草的抗虫机理,测定了叶片中烟碱含量并对植株组织进行切片染色.结果表明,烟碱含量与对照无显著差异;转基因烟草叶片增厚,细胞致密,细胞壁增厚可能是导致抗蚜虫、抗斜纹夜蛾的最直接因素之一.     

转番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因烟草植株的培育及其抗虫特性分析

将分离的番茄蛋白酶抑制剂Ⅱ基因cDNA序列tin2和含有一个109bp内含子的基因组DNA序列tin2i,分别构建成植物表达载体pBCT2和pBT2.然后通过农杆菌介导转化烟草叶片外植体,获得了两类转基因烟草植株.分子生物学检测和胰蛋白酶抑制剂活性分析结果表明,tin2序列和tin2i序列都能够在转基因烟草中正确表达.抗虫活性检测结果显示,转tin2i序列的烟草植株的抗虫活性高于转tin2序列的烟草植株,推测这可能与tin2i序列中内含子的存在有关.     

转基因抗虫棉花木质素含量及其生物合成关键酶活性研究

通过盆栽试验,以不同转基因抗虫棉花及其亲本对照为供试对象,研究木质素含量及其生物合成关键酶活性.结果表明:与非转基因棉花比较,在蕾期及铃期,转基因抗虫棉花Z30,CCRI41,SGK321叶片、茎秆组织中的木质素含量及叶片内的苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶活性发生了一些变化,但其显著性改变仅特异性地发生在某些品种、某些组织或某些时期内.在蕾期,转Bt基因棉花Z30茎秆组织中的木质素含量比其常规棉对照Z16显著下降,幅度达34.96%;转CpTI-Bt棉花CCRI41茎秆组织和SGK321叶片组织中的木质素含量比其常规棉对照显著下降,幅度分别为27.15%,13.22%.所有供试转基因抗虫棉花的木质...     

转ChIFN-γ基因烟草抗虫机制研究

为探索转ChIFN-γ基因烟草的抗虫作用机制,对虫体蛋白酶活性变化、烟草挥发性成分以及表皮腺毛密度进行了研究.结果表明,烟青虫进食转基因烟草量较少,导致其体内分泌蛋白酶量少、活力低;转基因烟草T0和T1代,黑松三烯和西柏三烯二醇相对含量较对照高;转基因烟草腺毛密度比对照高49.2%.ChIFN-γ基因激活的多种转录因子可能结合了腺毛发育相关基因的cis调节元件,上调了腺毛发育基因的表达,导致腺毛的数量增加,分泌的萜烯化合物增加从而具有显著的抗虫性.     

转蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶基因提高烟草的耐旱性

蔗糖: 蔗糖-1-果糖基转移酶（sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST）以蔗糖为底物催化生成蔗果三糖等低聚合度的果聚糖.将从莴苣中克隆的1-SST基因重组到pCAMBIA1300-als中，构建了在CaMV 35S启动子调控下的植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法将1-SST基因导入烟草中，PCR和Southern杂交检测表明获得了转基因植株，RT-PCR结果表明该基因在烟草中正常表达. 对T₀代转基因烟草进行的耐旱性分析结果表明，干旱胁迫6d的转基因植株丙二醛含量和电解质渗漏率显著低于未转基因对照，叶片相对含水量下降速度也明显比对照慢. 对转基因植株叶片糖分分析表明，转基因烟草植株积累果聚糖，并在干旱胁迫后含量明显增加，而未转基因对照植株不积累果聚糖. 在14%PEG溶液中未转基因烟草种子的萌发率仅为转基因烟草种子的一半；在附加200mmol/L甘露醇的培养基中未转基因烟草种子根的生长明显受到抑制，而转基因烟草根的生长发育正常. 以上研究结果表明，转1-SST基因烟草植株耐旱性的提高可能与该基因的表达有关.     

抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因在烟草中的表达

构建了含抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因ScFv-hTERT的植物表达载体p1304-SH,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草.转基因烟草植株叶片总DNA的PCR,Southern b lot检测结果表明,ScFv-hTERT基因已整合进了转基因烟草植株基因组中;RT-PCR,SDS-PAGE分析证实目的基因已在烟草叶片中成功表达,竞争性ELISA的结果表明,表达的重组抗体与其抗原有良好的结合活性.     

基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因(OSIPA)启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统,水稻Os GA3ox2(D18)启动子驱动水稻Os GA2ox1基因,玉米Ubiquitin启动子驱动BAR::GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab基因复合性状植物表达载体p GM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,获得了43株转基因烟草植株。结果表明,水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度,但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性,可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片,发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究,发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%,其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%~99.97%之间。     

由转基因产品论转基因烟草的安全性

随着转基因技术的不断发展,转基因生物安全问题在全球已经引起人们的广泛关注,围绕它的争论始终不断.烟草作为重要的经济作物和模式植物,也借助转基因技术平台在多个研究方向取得了可喜的进展.如通过植物基因工程技术将一些与抗虫、抗病、抗寒、抗旱、抗盐、抗除草剂以及与微量营养元素的吸收利用、光合作用等相关的外源基因构建到植物表达载体上,导入受体烟草细胞或组织中,由受体细胞或组织再生,最终获得这些品质性状得到改善的转基因烟草,同时还可以间接地减少化学肥料和农药的使用,节约成本,减少产量损失,减轻环境污染.面对转基因的诸多争论,我们必须客观、科学地对转基因的安全性进行评估,制定完善的政策和管理措施,既以慎重的态度保证转基因产品的安全,又要积极对待新生事物的发展,同时理性、正确地对公众进行科普宣传和指导,让广大消费者全面认知转基因产品.本文在简述转基因产品安全性的基础上,对转基因烟草的研究作出概括,并对转基因的发展趋势进行了展望.     

一个麻风树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的克隆和鉴定

通过PCR技术克隆得到一个麻疯树Kunitz型蛋白酶抑制剂基因(JcKTI)的开放阅读框序列(540bp),对应的基因组序列不含内含子.该序列编码一个含有179个氨基酸残基的成熟多肽,其在根和茎中的表达最高,在叶片和种子中较低.原核表达的重组蛋白显示出一定的抑制牛胰蛋白酶的活性,过表达该基因的转基因烟草蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制作用,同时转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻,摄食量减少.上述结果暗示JcKTI基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色.     

烟草烟碱转化相关蛋白质筛选分析研究

为了研究烟草中烟碱转化机理,应用比较蛋白组学方法研究了高烟碱烟草中烟碱转化相关蛋白质表达情况.采用双向电泳联用质谱技术比较了实验组高烟碱转化烟草叶片和对照组野生型烟草叶片的蛋白质差异,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.选取了34个差异蛋白质点,采用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,最终有12个蛋白质点得到了可靠鉴定,其中在实验组中相对下调的蛋白有7个,相对上调的蛋白有5个.通过比对蛋白质组库数据,发现这些差异表达的蛋白质主要是参与碳水化合物代谢、能量代谢等功能,而且亚细胞定位主要是在叶绿体和线粒体,表明这些蛋白表达水平与烟碱转化具有密切关系,为研究高烟碱转化率烟叶的形成机理提供了新的依据.     

新疆小拟南芥烯醛双键还原酶基因对转基因烟草耐盐性的影响

为了研究前期从新疆小拟南芥中克隆的编码烯醛双键还原酶(alkenal reductase)Ap AER基因的功能,本研究构建了带有花椰菜花叶病毒(Ca MV)的35S启动子的植物过表达载体35S:Ap AER,并转化至农杆菌GV3101中,采用叶盘法转化烟草获得了转35S:Ap AER基因的烟草。用250 mmol/L的Na Cl溶液分别胁迫转基因和野生型烟草2和4 d,并测定了脯氨酸(Proline)和丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)及过量化物酶(POD)酶活力等生理指标。结果表明:高盐胁迫下14 d,转基因烟草的长势明显优于野生型烟草,转基因烟草普遍植株较高、叶片大、叶色深;转基因烟草的Proline含量、CAT及POD酶活力均高于对照,而反映质膜受损情况的MDA含量显著低于对照。表明过表达Ap AER基因,能提高转基因植株清除醛自由基的能力、提高脯氨酸等渗透调节物质的含量及相关还原酶活性,从而显著提高转基因烟草的耐盐性。     

马铃薯乙醇酸氧化酶StGLO1对模拟水分胁迫的响应

为了解乙醇酸氧化酶在调控植物生长代谢及生物与非生物胁迫过程中发挥的作用。本研究以‘青薯9号’马铃薯为材料克隆乙醇酸氧化酶基因StGLO1,构建过表达载体并转化烟草,观察在干旱胁迫处理下转基因烟草和野生型烟草的长势,并测定了叶片中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量以及转基因根茎叶中StGLO1基因的表达量变化,验证过表达StGLO1烟草在干旱胁迫下的响应。结果表明:StGLO1(GenBank登录号XM_006348318.2)基因CDS为1 116 bp,编码371个氨基酸;干旱胁迫下,转StGLO1基因烟草的生长优于野生型,转基因烟草StGLO1基因的表达量在叶片中最高;转基因烟草中的游离脯氨酸、CAT、POD的含量高于野生型,达到差异显著水平(P0.05)。该结果为进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

抑制NtVTC1基因的表达延缓烟草生长发育

目的研究VTC1通过调控细胞内抗坏血酸(Ascorbic acid, AsA)的合成参与植物生长发育和响应逆境的重要功能。方法构建烟草VTC1基因的RNAi干扰表达载体RNAi-NtVTC1并转化烟草,通过抑制烟草VTC1基因的表达分析其影响植物发育的重要功能。结果将构建的干扰载体RNAi-NtVTC1转化烟草,成功获得了转基因株系RI。半定量PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明转基因烟草株系RI中NtVTC1基因的表达显著被抑制。AsA含量测定结果表明:与野生型烟草相比,转基因烟草株系RI的AsA含量均显著降低,为野生型的30%～40%。对烟草的表型观察发现,转基因烟草株系RI的发育显著受到抑制,尤其是在植株整体发育、叶片延展发育、开花等方面表现出显著延迟的表型。烟草抗氧化系统酶活性测定结果表明:转基因烟草株系RI中抗氧化系统酶活性如抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、过氧化物酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶的酶活性(GR)都显著降低。结论 VTC1基因在植物的生长发育过程中发挥着重要作用,为进一步深入研究VTC1基因的功能提供了良好参考。     

RNA干扰降低烟草植株中内源生长素水平

PCR扩增利用吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)全长序列,构建iaaH基因序列正、反向连接的的双元载体,通过农杆菌LBA4404介导,转化携带pTiC58 T-DNA的烟草叶片,获得携带正、反向iaaH序列的转基因植株.ELISA分析生长素的结果表明,转基因植物叶片的内源生长素含量明显降低,仅为pTiC58 T-DNA转化植株的56%,说明转基因烟草中发生iaaH基因转录后沉默,为利用该基因序列启动RNA干扰(RNAi),抑制冠瘿瘤病发生提供了实验依据.     

一个在麻疯树根和茎高表达的Kunitz型蛋白酶抑制剂基因JcKTI具有抗虫活性

通过RT-PCR和PCR技术,从麻疯树基因组中克隆得到一个Kunitz型蛋白酶抑制剂基因（JcKTI）的开放阅读框序列。对应开放读码框的基因组序列不含有内含子。该开放阅读框长度为540bp,编码一个含有179个氨基酸残基的成熟多肽,具有典型的Kunitz家族结构特征。组织特异性表达研究显示,JcKTI基因在根和茎中的表达丰度最高,在叶片和种子中表达较低。构建原核表达载体pET32-JcKTI在大肠杆菌BL21中表达,获得纯化的重组蛋白,该蛋白显示出一定的抑制牛胰蛋白酶的活性。将该基因在烟草中过表达,明胶酶法和BAEE法的结果均显示转基因植物的蛋白提取物对胰蛋白酶具有一定抑制作用,进一步的抗虫实验结果表明转基因烟草叶片可使进食后的棉铃虫幼虫生长发育受阻,并减少对叶片的吞食。上述结果暗示JcKTI基因可能在麻疯树根和茎的抗虫应答中扮演着一定的角色。     

应用液相色谱仪测定烟草4CL酶活性

应用液相色谱仪建立了烟草4CL酶活性测定方法,确定反应体积为0.2 mL,反应时间3 min应用该方法测定了4CL1转基因烟草的酶活性,结果表明反义Pt4CL1转基因烟草叶片的酶活性较野生型烟草叶片的4CL酶活性下降约22.7%～26.7%.     

转SOD基因烟草的光合特性初探

 以转基因Fe-SOD,Mn-SOD高表达、转基因Mn-SOD反义低表达烟草及非转基因品系为供试材料,比较CO₂光强对烟草光合作用和蒸腾作用的影响及不同叶位叶片的光合差异.在相同条件下,Mn-SOD高表达烟草CO₂补偿点最高(105μmol·mol^-1),Mn-SOD低表达烟草最低(78μmol·mol^-1),CO₂浓度对非转基因烟草蒸腾作用的影响比对其他三个转基因品系的影响要强.Mn-SOD低表达烟草的光补偿点最高(45μmol·m^-2·s^-1),而Mn-SOD高表达烟草最低(25μmol·m^-2·s^-1),并且强光对非转基因烟草的光合作用抑制大,转基因品系对强光具有较强的耐受力.同一叶位叶片,转基因烟草的光合速率、蒸腾速率更强.但转基因SOD高表达烟草在整体上并没有表现出明显的光合作用优势.     

葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在转基因烟草中的表达

通过PCR扩增,克隆了黑曲霉编码葡萄糖氧化酶的GO基因.构建了CaMV35S启动子驱动的GO基因植物表达载体,经农杆菌介导的遗传转化,获得了转基因烟草植株.经Southern,Northern和Western杂交分析,证明了GO基因在转基因烟草中的整合、转录和翻译.转基因烟草中H2O2的含量最高可达610μmol/L,比对照提高近5倍.嫁接试验证实H2O2可由砧木远距离运输至接穗,但不能由接穗转运至砧木,说明H2O2是通过导管由下向上运输.非转基因接穗嫁接至转基因砧木上3周,接穗上不同节位叶片中H2O2的含量不存在浓度梯度,说明这是一种主动运输而不是被动扩散.     

过量表达SlOPA3-like基因对烟草叶片叶绿体发育的影响

3型视神经萎缩蛋白(Optic atrophy type 3,OPA3)普遍存在于真菌、植物和动物中,但它在植物中的功能尚不清楚。本研究构建了番茄OPA3-like (SlOPA3L)基因的过表达载体35S∶∶SlOPA3L并遗传转化烟草。与野生型烟草叶片相比,过量表达SlOPA3L基因的转基因烟草的子叶呈花叶状、部分组织失绿,转基因烟草的少数早期真叶呈花叶表型,随着叶片发育后又逐渐恢复正常。转基因烟草的叶片细胞表型分析表明:真叶花叶的叶片的海绵组织和栅栏组织发育受到显著的影响。这些结果表明:Sl OPA3L基因可能影植物叶片细胞的分裂和参与植物叶片发育早期的叶绿体形成。     

转基因烟草中过量生长素对叶片生长发育的影响

分别构建了iaaM、iaaM和ipt共表达植物转化载体,农杆菌介导转化烟草,RT-PCR鉴定转基因株系,ELISA方法分析叶片IAA、IPA和ZR含量.结果表明:叶片IAA含量高低依次为株系iaaM10、iaaM_ipt3和野生型;而细胞分裂素含量高低依次为iaaM_ipt3、野生型和iaaM10.随着内源IAA水平升高,气孔密度减小、保卫细胞长度增加、栅栏组织细胞增大和叶片厚度增加.讨论了生长素和细胞分裂素含量对叶片细胞生长发育的影响.