包涵体复性研究

包涵体的形成是外源重组蛋白质在大肠杆菌中高效表达的必然结果，也是目前产生重组蛋白质最有效的方法之一、综述了国内外在外源重组蛋白复性研究方面的主要进展，包括包涵体的分离和溶解、外源重组蛋白复性的原则、影响复性的物理因素及各种复性方法．     

大肠杆菌表达的成骨蛋白-1的复性研究

带有rhOP-1／pBV221-的E．coli表达得到的rhOP-1以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性剂溶解后,经过DEAE-FF纯化,得到高纯度的目的蛋白。利用各种不同方法对蛋白质进行复性,并对复性结果进行比较,发现添加氧化还原剂最有助于二聚体的形成,这是由蛋白质分子的结构和理化性质决定的。     

XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究

常规诱导表达后收集的粗包涵体经3mol／L尿素洗涤加上表面活性剂Triton X-100作用，可将包涵体中xynⅢ的含量从37％提高到92．4％；8mol／L尿素可将包涵体完全溶解；蛋白浓度在0．2～0．25mg／mL时，pH4．550mmol／L NaOAc与pH7．520mmol／L Tris—HCl缓冲液复性效果相当；降低蛋白浓度，则是pH7．520mmol／L Tirs-HCl缓冲液复性效果相对较好；复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高；pH7．520mmol／L Tris—HCl、0．01mg／mL蛋白浓度条件下，包涵体的复性效果最佳．     

rPA(K)原核表达产物的复性与纯化

为探索新型rPA(K)在原核系统中表达产物的纯化和复性,采用不同的洗涤剂(脲、Triton X - 100、乙醇)依次洗涤包涵体,又经硫酸铵沉淀,得到了经初纯后纯度较高的包涵体.结果表明,经2mol/L脲、1mL/L Triton X - 100、200mL/L乙醇洗涤,15%饱和度的硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0% 提高到56.6%.在此基础上,利用稀释复性和透析复性2种方法对包涵体进行复性,以恢复产物的天然构象,获得具有生物学活性的目的蛋白.结果如下:采用透析复性法,rPA(K)的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,rPA(K)的比活可达1.06×105IU/mg.利用S·TagTM rEK纯化试剂盒对目的产物进行进一步纯化,并对rEK和MgCl22种洗脱剂的洗脱效果进行了比较.SDS - PAGE结果显示,MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43ku,其纯度为72%;而rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40ku,表明去除了融合蛋白中的非目的片段.     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.     

重组人肌肌酸激酶包涵体复性条件的探究

采用稀释法研究了重组人肌肌酸激酶(HCK)包涵体的复性条件:蛋白质量浓度、变性剂浓度、复性时间、温度、氧化还原条件等,得到了较为适宜的复性条件.实验还同时发现非离子型去垢剂Triton X-100能有效地辅助HCK的复性,β-环糊精对HCK的复性没有辅助作用.     

用金属螯合柱一步纯化和复性重组人血管生长抑制因子(rhB)

rhB基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在 .利用其产物N端携带 6个连接的组氨酸与金属螯合层析介质中的镍离子的亲和性 ,应用Ni -NTA金属螯合层析在蛋白质变性条件下进行纯化 ,并对纯化样品的复性进行了研究 ,分析和比较了不同复性方法和复性条件对其复性率的影响 .实验结果表明 ,在变性条件下经纯化的样品在Ni柱上不经洗脱 ,用 8.0mol/L～ 1.0mol/L尿素梯度洗涤可使样品在柱上直接复性 .用该法除了可有效地提高复性率外 ,还可使整个纯化过程变得简单、快速和高效 .一步层析即可得到高纯度的且具有生物活性的rhB .     

缺失Cys45—Cys50二硫键的三种突变体凝乳酶原复性的比较研究

通过对（Ｃｙｓ－Ａｓｐ）４５／（Ｃｙｓ－Ｓｅｒ）５０，（Ｃｙｓ－Ａｓｐ）４５和（Ｃｙｓ－Ｓｅｒ）５０３种突变体凝乳酶原复性的比较研究，发现：１．３种突变体凝乳酶原多肽链复性的条件基本一致。（２）ＰＤＩ能有效地促进３种突变体凝乳酶原的复性；３．３种突变体凝乳酶原的活化条件一致；４．单突变体凝乳酶原多肽链正确折叠的效率低于双突变体。基于上述结果，我们认为，Ｃｙｘ４５－Ｃｙｓ５０二硫键的形成有利于凝乳酶     

大肠杆菌中重组猪生长激素提取方法及变复性的比较研究

通过对基因工程菌pgh／E．coli BL21用酶溶解、超声波处理、超声波处理与液氮冻融相结合三种方法进行破菌，用盐酸胍法进行变复性，提取重组猪生长激素(rpGH)．结果表明用超声波处理与液氮冻融相结合的方法裂解细菌，盐酸胍法变复性，rpGH的提取率最高，达72．16％；而用尿素法对rpGH在大肠杆菌内所形成的包涵体变复性，rpGH的提取率仅为49．82％．     

重组葡激酶的高效表达与纯化

通过发酵和纯化条件的研究,建立适合重组葡激酶工程菌的发酵和纯化工艺.对重组葡激酶工程菌发酵过程中的pH、饱和氧浓度、补料以及诱导时间进行考察,获得该工程菌的高效表达条件.在此条件下,重组葡激酶表达水平在50%以上,并以活性可溶性状态存在于细胞内;经渗滤,超滤浓缩、透析,DEAE-Sepharose FF层析和SP-Sepharose FF层析后,经SDS-PAGE和HPLC分析,纯度达到99%.在还原条件下进行SDS-PAGE分析,测得该酶相对分子质量为15.5kD,等电聚焦显示其等电点为8.4.     

大肠杆菌酒石酸脱氢酶β亚基的克隆、表达、纯化及包涵体的复性

利用PCR技术从大肠杆菌BL21中获取酒石酸脱氢酶β亚基基因(TtdB),并将之克隆到质粒pUC18上,转化大肠杆菌DH5α细胞.经测序证明序列无误后,将之与表达载体pTrcHisC连接,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和双波长扫描分析,确定酒石酸脱氢酶β亚基在大肠杆菌中表达时以包涵体形式存在.目的蛋白用TALON金属亲和树脂纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性.复性产率可达90%.     

重组葡激酶突变体K35R纯化过程中宿主菌菌体蛋白残余量的免疫分析

葡激酶突变体K35R(DGR)是双功能葡激酶突变体,是正在开发的治疗血栓性疾病的新药.为检测DGR纯化过程中宿主菌菌体蛋白的残留,建立了宿主菌菌体蛋白的免疫分析方法.用所制备的宿主菌菌体蛋白免疫新西兰兔,得到菌体蛋白的抗血清.使用SDS-PAGE和基于抗血清的免疫印迹方法检测DGR纯化过程中菌体蛋白的去除.进一步建立了对宿主菌菌体蛋白灵敏的酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,其检测线性范围是5～100μg/L,并用ELISA法定量测定了纯化过程中中间产物和纯化产品中菌体蛋白的含量.     

重组葡激酶(r-Sak)工程菌发酵工艺的研究

通过对影响重组葡激酶表达的几个主要因素的研究，建立了较为适宜的发酵条件：接种量4%；初始pH7.2；在A600nm=2.5时加20%蔗糖诱导，诱导后4～5h收获，发酵液上清r-Sak含量可达到250mg/L以上，酶活力可达到6500RU/ml以上。     

基因工程血管抑素3A蛋白的分离纯化

在8mol／mL尿素溶液中,以二硫苏糖醇(DTT)为还原剂,对基因工程血管抑素3A包涵体进行溶解实验。结果发现：1．5h后溶解的上清液蛋白浓度达26．2mg／mL。SDS-PAGE电泳扫描结果显示,3A蛋白经过Sephadex G75分离后PAGE电泳纯达到100％,该步收率达85．82％,相对分子质量为10ku。采用分步稀释法对其进行复性,所获复性3A蛋白经MTT法检测表明：3A蛋白浓度为0．1μg／mL时,对内皮细胞的生长抑制率为93．4％。     

人ERCC1在大肠杆菌中的表达研究

人ERCC1基因是与核苷酸切除修复有关的基因 .为了对其结构和功能进行进一步研究 ,将ERCC1基因放入大肠杆菌中进行表达 .试验中发现表达产物大多以包涵体的形式存在 .为了提高表达产物的可溶性表达 ,实验了 3种方法 :将ERCC1与GROES/EL共表达 ,将ERCC1与PDI共表达及在低温下进行ERCC1的表达 ,最终发现低温表达使可溶性表达显著上升     

重组人内皮抑素层析复性的相关研究

研究了由大肠杆菌表达的重组人内皮抑素(Recombinant human endostatin,rhES)的复性、纯化过程.比较先层析复性后纯化(工艺1)和先纯化后层析复性(工艺2)两种工艺的结果表明:工艺1所得rhES的收率和活性回收率分别为64.44%和213.19%,与工艺2相比分别提高8.70%和33.04%.工艺1中,研究了3种凝胶过滤柱复性及复性pH和上样蛋白浓度对复性的影响,并优化相关工艺.结果表明:在pH9.0,rhES浓度3.91 mg/mL的条件下,采用双梯度凝胶过滤Sephacryl S-100 HR进行层析复性,Sephadex G-25脱盐后,用SP Sepharose FF阳离子交换吸附纯化,获得活性回收率为213.19%,HPLC纯度为97.07%的rhES,其IC50为1.58 ug/mL.     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

降钙素受体药物靶点区域的表达、复性及鉴定

本实验截取了人降钙素受体N端胞外结构域涉及药物靶点的第20~160位氨基酸残基区域对应的编码序列,根据大肠杆菌偏爱密码子优化后,人工合成相应的基因,运用分子克隆技术将所合成的基因克隆到pET22b(+)载体,重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达.结果表明,Nt-CTR蛋白质以包涵体形式表达,所得包涵体蛋白质通过高效的复性方法,最终得到了大量纯化的可溶性Nt-CTR蛋白质.融合蛋白质通过Western-Blot鉴定表达正确.本研究为CTR的结构研究和CTR相关疾病的药物筛选提供了基础.