鲤鱼NOD1基因克隆与组织特异性表达分析

利用RT-PCR技术在鲤鱼(Cyprinus carpio)中首次克隆得到了NOD1基因编码序列全长。生物信息学分析发现,鲤鱼NOD1具有3个保守结构域和相应的保守位点,在进化中与草鱼亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析NOD1基因在鲤鱼不同组织中分布发现,NOD1在头肾和血液中表达最高,在肌肉、皮肤和性腺中表达量最少;鳗弧菌(V.anguillarum)刺激后NOD1基因在肝脏、脾脏、头肾和前肠中表达量都有明显上升。研究结果显示NOD1在鲤鱼应对鳗弧菌刺激天然免疫过程中可能发挥着重要作用。     

大黄鱼Rac2基因的克隆及其抗病免疫作用分析

克隆了大黄鱼ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)基因(命名为lycRac2),并从本实验室大黄鱼基因组数据库中获得了lycRac2基因的全长序列。lycRac2基因全长1670.427 kb,包含7个外显子、6个内含子,其c DNA序列全长1221 bp,ORF为579 bp,编码192个氨基酸。同源性比较结果显示,从鱼类到哺乳动物,RAC2蛋白的氨基酸序列相当保守,其基因均具有7个外显子和6个内含子,但不同物种之间7个外显子和6个内含子的长度都不一致。实时定量PCR检测结果显示,lycRac2基因在肝脏、脾脏、肠、胃、肾、头肾、肌肉、皮肤、脑、鳃、心脏、血液中均有不同程度表达,其中在头肾中表达量最高,肌肉中表达量最低。大黄鱼受到LPS(脂多糖)、poly I:C、副溶血弧菌刺激后,肝脏、脾脏、头肾中lycRac2基因表达量明显上调,显示lycRac2基因参与了大黄鱼的免疫反应,其可能具有对细菌和病毒的抗病免疫作用。通过原核表达还获得lycRAC2蛋白,为进一步研究其性质和功能奠定了基础。     

日本鳗鲡γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因的克隆鉴定与表达分析

在日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得2个γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶(GILT)基因AjGILT-1和AjGILT-2,并对其序列进行生物信息学分析,进而利用实时荧光定量PCR分别检测2个基因在不同组织器官中的表达水平,及其在脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达变化.结果显示:2个基因编码的蛋白序列中均含有GILT家族的特征序列CQHGX2ECX2NX4C、活性位点CXXC、2个糖基化位点和11个保守的半胱氨酸残基,基因组序列均含7个外显子和6个内含子.2个基因启动子中都存在多个转录因子结合位点,如γ-干扰素活化位点以及特化蛋白1结合位点;不同的是AjGILT-1启动子区存在多个核因子-1、激活蛋白-1结合位点及干扰素刺激反应元件,而在AjGILT-2启动子区未发现.AjGILT-1在鳃和肠中表达量最高,而AjGILT-2在性腺、头肾和脾脏中表达量最高;除肠道外,同一组织中AjGILT-2的表达量均高于AjGILT-1.LPS、PolyI:C刺激和E.tarda感染后,AjGILT-1与AjGILT-2的表达在鳃中仅有少数变化,而在头肾和中肾中则变化较明显.综上所述,AjGILT-1和AjGILT-2基因可能参与了日本鳗鲡受病毒和细菌感染后的免疫应答.     

斜带石斑鱼干扰素调节因子8基因的鉴定与表达模式分析

干扰素调节因子8(IRF8)是IRF家族转录因子中的一个成员.利用简并PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)技术获得了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)IRF8基因(EcIRF8)全长cDNA序列,其编码422个氨基酸残基的蛋白质,含有脊椎动物IRF家族的特征性结构域,即N端保守的DNA结合结构域(DBD)和C端多样化的干扰素调控因子结合结构域(IAD),其中DBD中包含5个特征性的色氨酸残基和1个核定位信号.与绝大多数脊椎动物的IRF8基因相似,EcIRF8基因组序列也是9个外显子和8个内含子的结构.EcIRF8在斜带石斑鱼肝脏中高水平表达.活体聚肌胞苷酸刺激后6h,EcIRF8在头肾、中肾、胸腺、肝脏和肠中的表达量显著上调(p0.05),其中在中肾中上调幅度最大,是对照组的106倍;副溶血弧菌(Vibrio paraheamolyticus)刺激后24h,EcIRF8在肝脏中的表达量也显著上调(p0.05),但上调倍数仅为对照组的9.37倍.结果表明,EcIRF8基因可能主要参与斜带石斑鱼的抗病毒免疫反应.     

尼罗罗非鱼IgT重链的蛋白表达及表达分析

IgT（Immunoglobulin T）作为新型免疫球蛋白在粘膜免疫中具有重要作用. 文中根据尼罗罗非鱼IgT基因序列构建原核表达载体获得IgT重组蛋白,相对分子量约75 kDa,并制备出效价较高的小鼠抗罗非鱼IgT的多克隆抗体. 荧光定量PCR检测证明：健康尼罗罗非鱼中IgT在多种组织中都有表达,其中脾脏、皮肤、肠和鳃中表达量相对较高. 无乳链球菌感染后,皮肤和头肾中IgT mRNA的相对表达量分别在12 h和4 d显著上调. 免疫组化结果显示：IgT蛋白在头肾和皮肤中均有少量分布,在无乳链球菌刺激后,在皮肤中出现大量分布. 以上结果表明:IgT在尼罗罗非鱼皮肤粘膜免疫中具有重要作用.     

免疫相关基因在健康革胡子鲶不同组织的表达分析

应用荧光定量PCR法分析抗菌肽hepcidin、c型溶菌酶和MHCⅠ基因在健康革胡子鲶肝胰脏、脾脏、胃、肠道、肾脏、头肾、心脏、脑、鳃、鳃上器官、背部皮肤、背部肌肉和尾鳍13种组织中的表达.结果显示:3种基因在以上组织中均有表达,Hepcidin基因在脾脏中表达最高,显著高于除肾脏以外的其它组织(P0.05);c型溶菌酶基因在胃中表达量最高,与其余组织的表达差异显著(P0.05);而MHCⅠ基因在脾脏和鳃中表达量相对较高,但13种组织间的表达差异不显著(P0.05).     

鲤鱼LGP2的基因克隆与表达

利用反转录-聚合酶链式反应和互补脱氧核糖核酸(cDNA)末端快速扩增技术克隆得到鲤鱼的遗传和生理学实验室蛋白2(LGP2)基因的cDNA全长,并对其在鲤鱼抵抗病毒和细菌感染过程中的免疫作用进行研究。结果表明:鲤鱼的LGP2的cDNA全长共2 978 bp,开放阅读框为2 037 bp,编码679个氨基酸;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测鲤鱼的LGP2的信使核糖核酸(mRNA)表达于所有被测组织中,且在鳃和脑中的表达量较大,而在性腺和血液中的表达量较小;采用poly I:C和嗜水气单胞菌腹腔注射刺激鲤鱼后,各组织中LGP2的mRNA表达量均有所增大;LGP2是鲤鱼以依赖维甲酸诱导基因I样受体(RIG-like receptors,RLR)信号通路的方式进行抗病毒和抗细菌天然免疫过程中的重要调节因子。     

斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

斜带石斑鱼转化生长因子β1（TGF β1）基因的克隆及表达分析

  转化生长因子β1（TGF β1）是一种高度保守的多效细胞因子。通过分子克隆得到了斜带石斑鱼Epinephelus coioidesTGF β1 cDNA全长序列,全长为2 477 bp,开放阅读框为1 161 bp,编码一种含386个氨基酸的多肽。Realtime PCR分析表明,TGF β1基因在健康斜带石斑鱼所取组织中均有表达,肾脏中表达最高,其次是头肾和脾脏。用PolyI:C或ConA刺激斜带石斑鱼头肾淋巴细胞,TGF β1表达量明显上升,且在刺激4 h后达到最高值。用PolyI:C刺激16、24 h后,TGF β1几乎不表达,而用ConA刺激实验组,TGF β1表达量一直高于对照组。结果说明,斜带石斑鱼TGF β1基因结构和表达特征与其他硬骨鱼类具有高度相似性。     

淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

为了研究HSP70(heat shock protein 70)是否可作为淞江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)养殖中的应激监测分子指标,根据鲤鱼热应激蛋白70基因序列(AYl20894)设计并合成引物,以淞江鲈肝脏组织总RNA为模板,获得淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列,长度为480bp,GenBank登陆号为KC342053.序列分析结果显示此序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)等有较高的同源性.同时,应用所获淞江鲈HSP70基因部分序列,以淞江鲈β-actin基因的序列(HM449124)为内参,利用荧光定量PCR技术,检测淞江鲈肌肉、肠、脑、皮肤、性腺、肝脏、心脏、鳃、鳍9个组织的表达差异.结果表明,HSP70在淞江鲈9个组织中普遍表达,其中在鳍中表达量最高,在性腺、鳃、脑、肌肉、肝脏、皮肤、肠中的表达量依次递减,在心脏中表达量最低.在鳍中HSP70的表达量可能成为衡量淞江鲈应激程度的指标.