利用脂肪酶Novozym 435催化转酯反应对映选择性合成(R)-α-硫辛酸的手性前体

利用商品脂肪酶Novozym 435介导的对映选择性转酯反应催化拆分(R,S)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯(ECHO),以合成(R)-α-硫辛酸的手性前体。对酶促拆分反应的条件进行了优化,确定了该酶的最适反应条件:以乙酸乙烯酯为酰基供体,最适反应温度为50°C,以异丙醚为反应介质,酶最适上载量为100g/mol ECHO,可以耐受的底物浓度为1mol/L。在产品的克级制备反应中,6h底物转化率为47%,产物(R)-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的对映体过量值(eep)为90%,时空产率高达471g/(L·d),产品总收率为36.3%。该酶法催化的转酯化反应为(R)-α-硫辛酸的合成提供了一条新的途径。     

固定化脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油

对比多种载体固定化脂肪酶的吸附效果,确定了以大孔吸附树脂D101为载体,采用先吸附后交联的方法固定脂肪酶。固定化后脂肪酶的稳定性得到较明显改善,最适反应温度50℃,最适反应pH值为8。确定了固定化脂肪酶催化棉籽油与甲醇转酯化反应合成生物柴油工艺条件,醇油比3∶1,含水量1.25%(V/V),加入质量比(酶量与固定化载体)0.48的固定化酶,反应介质辛烷,在40℃反应24h催化生物柴油的合成,最高转化率可达到65%。     

以产气肠杆菌催化肌苷5′-位磷酸化的特性

为了分析磷酸酶在菌体细胞内的存在方式、酶反应特征及产物结构,以产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)细胞作为催化剂,以焦磷酸和肌苷为底物,并采用液相色谱和核磁共振等方法进行了研究。酶促反应产物被证实为5′-IMP。结果表明:该酶为胞内酶,具有可溶性的特点;酶促反应温度范围30~40℃,最适温度为35℃;整细胞酶促反应的最适pH值为4.8,催化16 h可以合成4.79 mg.mL-1的5′-IMP;破碎细胞,酶促反应的最适pH值为7.6,催化10 min可以合成5.85 mg.mL-1的5′-IMP。     

固定化蛋白酶区域选择性催化合成蔗糖己二酸单乙烯酯

用固定化蛋白酶FG-F在有机溶剂中催化蔗糖和己二酸二乙烯酯(DVA)合成了蔗糖己二酸单乙烯酯.用吸附法以硅藻土为载体研究了蛋白酶FG-F的固定化.固定化条件优化为:pH值8～10,温度为20～40℃,磷酸盐缓冲溶液的浓度范围为0.02～0.06 mol/L,酶与硅藻土的质量比为1:6.固定化酶在含水量为0.25%的DMF中,于45℃,220 r/min,pH值为8时,转酯化催化活力最高.转酯化反应3 d,DVA生成2-0-己二酸单乙烯基蔗糖酯的转化为52%.     

新型脂肪酶LipB52催化生物柴油

一种来源于荧光假单胞菌的新型脂肪酶基因lipB52在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,并且利用Ni-NTA亲和柱时脂肪酶LipB52进行纯化.采用固定化脂肪酶LipB52催化大豆油与甲醇的转酯反应生产生物柴油.实验考察了温度、底物摩尔比、酶用量、有机溶剂、酶的种类以及油的类型对于反应的影响,结果表明:转酯反应的最佳反应条件为:m(酶):m(油)=20:80,n(油):n(甲醇)=1:4、正庚烷作为溶剂、反应温度为30℃,在此条件下脂肪酶LipB52表现出很高的催化活性,反应40 h后甲酯的产率高达92%.     

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以pET-22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过PCR成功克隆到该菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侣基因(lipPA-9B),并构建共表达重组质粒pET22b-lipPA-9A-9B,实现脂肪酶LIP-9A的活性表达。酶学性质研究表明LIP-9A的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNPO);同时,LIP-9A还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。     

木瓜蛋白酶作用下酰基氨基酸酰苯胺的不对称合成的研究 Ⅱ.外消旋丝氨酸的析解

1.在木瓜蛋白酶作用下,N-酰基-DL-丝氨酸与苯胺作用合成了N-异戊酰-、N-正己酰-、N-苯甲酰-及N-苯甲氧羰酰-L-丝氨酸酰苯胺。 2.脂肪族取代基,正己酰-,取代的丝氨酸酰苯胺不对称合成反应的最适pH为4.9～5.1;芳香族取代基,苯甲氧羰酰-,取代的丝氨酸酰苯胺不对称合成反应的最适pH为5.0～5.2。 3.比较了四种酰基-丝氨酸的酰苯胺合成的速度。N-苯甲氧羰酰-L-丝氨酸酰苯胺最快;N-苯甲酰-,N-正己酰-其次;N-异戊酰-最慢。 4.在最适pH,酶浓度自1.31毫克蛋白N/毫升反应液提高到2.27毫克蛋白N/毫升反应液时,N-苯甲氧羰酰-L-丝氨酸酰苯胺的产率,在24小时自76.43％提高到100％。 5.在pH=5.0～5.2,柠檬酸缓冲液浓度自0.2M提高到1.0M时,N-苯甲氧羰酰-L-丝氨酸酰苯胺的产率,在12小时提高了1％。 6.选定了苯甲氧羰酰基为取代基;反应最适pH=5.0～5.2;酶浓度为2.2毫克蛋白N/毫升反应液;缓冲液浓度为0.2M;作为丝氨酸酰苯胺不对称合成的最适条件,在此条件下进行了实际析解,得到中间产物N-苯甲氧羰酰-L-丝氨酸酰苯胺,与此同时,还得到了N-苯甲酰-、N-正己酰-、N-异戊酰-L-丝氨酸酰苯胺。 7.水解N-苯甲氧羰酰-、N-苯甲酰-、N-正己酰-、N-异戊酰-L-丝氨酸酰苯胺,得到了L-丝氨酸,水解N-苯甲氧羰酰-D-线氨酸,得到了D-丝氨酸,两个旋     

固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coli BL21 (pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽(GSH).从酶活收率及机械强度方面进行比较,选择卡拉胶为包埋载体,其最适pH为7.0,最适温度为40°C.相关物质对GSH的合成均有影响半胱氨酸、甘氨酸的最适浓度为20mmol/L,谷氨酸的最适浓度为60mmol/L;Mg2+/ATP为1～5(V/V)较合适;腺苷二磷酸(ADP)浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%.优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L,操作稳定性较好;延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%;与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应,GSH合成量达1.24g/L,收率比直接加入ATP提高24.2%.     

酶法合成组胺的研究

为探究生物催化法合成组胺,通过对IPTG浓度、诱导时间和酶学性质的研究,确定组氨酸脱羧酶诱导表达条件以及最适反应条件.结果表明:不同IPTG诱导浓度对酶活影响不大;酶活随着诱导时间的增加而升高;酶反应最适温度为30℃,pH为6.0;随着产物浓度增加,酶活降低,具有产物抑制现象;5%底物时转化率达到60%,3%底物时转化率达到97.7%.可见,该组氨酸脱羧酶有工业应用开发潜力.     

产酸克雷伯氏菌氢酶分离提纯与特性的初步研究

采用硫酸铵沉淀和柱层析 (DEAE-Sepharose F.F., Sephacryl S-200, TSK-DEAE)初步分离纯化了产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HP1可溶性氢酶,研究了温度、pH值、电子载体等对氢酶催化放氢活性的影响.研究表明,可溶性氢酶催化放氢的最适温度为30℃,催化放氢的最适pH值为7.5,甲基紫晶(MV)是氢酶催化放氢的最适人工电子载体,氧对氢酶催化活性有较大的抑制作用.     

超声作用下的酶促废油脂转酯反应

探讨了超声对无溶剂体系中固定化脂肪酶Novozym435催化废油脂转酯反应的促进作用，研究了超声功率、超声处理方式等对酶反应速度及酶操作稳定性的影响．结果表明：对酶进行适宜的超声预处理（20kHz，80W，30min）能显著提高Novozym435催化废油脂转酯反应的速度；经超声预处理的Novozym435有良好的操作稳定性，反应10批次后．酶活下降甚微．     

丙酰辅酶A的体外酶法合成

丙酰辅酶A(丙酰-CoA)是一种重要的代谢中间物,可以用来生产丙烯酸、3-羟基丙酸、β-羟基戊酸和聚酮化合物。将天然的琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶在大肠杆菌中克隆并过表达,采用这3种纯化的酶体外催化合成丙酰-CoA,评价了琥珀酸生产丙酰-CoA代谢途径。琥珀酸可经琥珀酰辅酶A合成酶催化生成琥珀酰-CoA,琥珀酰-CoA再由甲基丙二酰辅酶A变位酶催化生成甲基丙二酰-CoA,最后甲基丙二酰-CoA经甲基丙二酰辅酶A脱羧酶催化生成丙酰-CoA。反应产物经高效液相色谱分析,检测到目标产物丙酰-CoA,结果证明了从琥珀酸体外合成丙酰-CoA的代谢途径的可行性。     

交联海藻酸钙凝胶固定化酵母醇脱氢酶研究

对用海藻酸钙包埋、戊二醛交联法固定酵母醇脱氧酶催化苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸的过程进行研究,比较游离酶与固定化酶的酶学性质.实验结果表明:固定化酶的热稳定性显著提高,游离酶在70℃时酶蛋白变性失去活力,而固定化酶在65℃保温1 h的能保持64%的酶活力,在70℃时酶活力仍町保留48.6%;固定化酶的最适温度由30℃升至40℃,最适反应pH值由6.8下降为5.8;固定化酶保留了62.72%的游离酶活性, 固定化酶的表观米氏常数和最大反应速率分别为37.33 mmol/L和358.42 nmol/min.该固定化酶具有良好的储存稳定性和操作稳定性.     

二氧化硅负载硫酸镧催化合成乙酸正丁酯的研究

以二氧化硅负载硫酸镧为催化剂.催化合成了乙酸正丁酯.研究了原料比例、催化剂用量、反应时问、催化剂重复使用效果等冈索对酯化率的影响,确定了较佳的工艺条件.结果表明,反应的最佳条件为:酸醇摩尔比(mol/mol)为1.0:2.0,催化剂的用量为冰乙酸用量的2.0%(质量比),反应温度为110～115℃.反应时间为2.0h,乙酸的转酯化率为95%以上.     

高山离子芥磷脂酶Dα编码区基因序列克隆与表达载体构建

磷脂酶D(PLD)是重要的细胞磷脂代谢酶,在植物的生长及对不良环境胁迫的抵御反应中起重要作用.本试验以高山离子芥(Chorispora Bungeana)为材料,取幼叶分离mRNA,反转录合成cDNA,PCR扩增加XbaΙ和SacΙ酶切位点的高山离子芥磷脂酶Dα(PLDα)编码区序列、测序.结果表明插入片段为PLDα目的基因片段,全长约1 600bp,blast比对发现该序列与Genbank中报道的拟南芥PLDα基因相比同源率为94.6%.回收纯化PCR产物,克隆至pTG19-T载体双酶切后将目的基因片段定向克隆至pBI-121载体,构建高山离子芥PLDα基因编码区片段的表达载体pBI121-PLDα,双酶切及PCR鉴定结果显示表达载体构建成功,为下一步进行抗逆转基因作物选育奠定了基础.     

固定化脂肪酶催化（R，JS）-1-苯乙醇转酯化拆分反应及动力学研究

利用制备的舍Fe304无机磁性复合物FSN固定假单胞茵脂肪酶（Pseudomonas sp Lipase,PSL）,获得具有高活性、高对映体选择性和易分离的固定化酶PSL／FSN．乙酸乙烯酯做酰化试剂,PSL／FSN在正庚烷溶剂中催化（R,S）-1-苯乙醇转酯化拆分反应,40℃反应2h时,（S）-1-苯乙醇对映体过量值eep和（R）-乙酸-1-苯乙酯的对映体过量值eep均为99％,（R,S）-1-苯乙醇的转化率达到理论值。固定化酶PSL／FSN在70℃经2h热处理,其活性和对映选择性没有明显的下降;PSL／FSN重复使用10次,其活性和对映体选择性未出现衰减。基于实验数据,研究了固定化酶催化（R,S）-1-苯乙醇转酯化拆分反应的动力学行为,获得了（R,S）-1-苯乙醇转酯化拆分反应的动力学方程。     

小分子对氯化血红素催化性能的影响

以氯化血红素(hemin)催化H2O2氧化邻苯三酚红反应为指示反应,研究了氨基酸、有机碱、表面活性剂等多种小分子对hemin催化性能的影响．发现,L-精氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸对hemin的催化性能有明显的增强作用．并使其最适pH更接近天然过氧化物酶的最适pH;具有芳香结构的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠胶团(SDBS)也可提高hemin的催化性能,且与L-精氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸有明显的协同效应．该结果可为hemin与保守氨基酸衍生表面活性荆胶团模拟过氧化物酶研究提供科学依据．     

磷脂酶D产生菌株的筛选及其转磷脂化反应特性

采用磷脂平板筛选法,从土壤中筛选出一株1株能够降解磷脂的菌株SNUPLD-6.经验证SNUPLD-6产的磷脂酶为胞外酶含有高效磷脂酶D(PLD).对该菌形态特及ITS序列进行分析,将其鉴定为地霉属的白地霉(Geotrichum candidum).对该菌的生长条件及该菌产的PLD的转磷脂反应的条件进行优化,实验结果表明:该菌株的最适生长温度为30℃,最适pH为6,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为牛肉膏和蛋白胨各50%.该菌产PLD最适发酵周期为3d.该PLD的转磷脂化反应最适反应温度为32℃,最适pH为5.5,最适的反应缓冲液为0.02M的醋酸-醋酸钠缓冲液,最适的金属离子激活剂为Ca2+、Zn2+.     

功能性磷脂的酶法合成及其生理功能研究进展

磷脂是油脂中的主要伴随物,被证明具有抗氧化等多种保健功效,但加工有营养价值的磷脂产品对生产工艺有特定的要求,对于实现有营养性的磷脂存在难度,而且在我国的市场利用情况并不好,造成了大量资源的浪费。目前,多数的磷脂都是简单的利用与开发,在饲料、食品等行业中都没有得到充分的加工与利用。酶法催化具有反应条件温和、高度专一性和脂肪酸专一性等良好性质,因此,通过专一性脂肪酶催化合成高附加值的功能性磷脂产品尤为重要。介绍了功能性磷脂的研究现状,就近年来的酶法合成功能性磷脂的底物选择、脂肪酶筛选、合成方法、脂肪酸组成分析等方面的研究状况进行系统阐述,并对今后功能性磷脂的研究做了展望。     

生物法合成熊去氧胆酸研究进展

熊去氧胆酸(UDCA)是治疗肝胆疾病的基础性药物,对某些癌症和神经系统疾病也有辅助治疗作用。化学工艺合成UDCA对环境不友好、收率低,尚不能满足生产需求;生物法合成UDCA具有转化率高、节省能源、对环境友好的特点,目前是UDCA合成的研究发展方向。生物法合成是以廉价易得的鹅去氧胆酸(CDCA)、胆酸(CA)或石胆酸(LCA)为底物,通过7α-HSDH、7β-HSDH、LDH和GDH四种酶催化合成UDCA,合成方法分为游离酶催化和全细胞合成,其中游离酶催化常采用“一锅两步法”或“一锅一步法”合成UDCA;全细胞催化是以构建的工程细胞作为反应容器,利用细胞表达的酶系催化合成UDCA。本文综述了游离酶催化和全细胞合成UDCA的相关用酶、合成方式及合成工艺的研究进展,为UDCA的研究生产提供技术参考。