褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

茉莉酸信号传导途径参与了水稻的虫害诱导防御过程

采用RT-PCR的方法, 对茉莉酸信号传导途径在水稻虫害诱导防御中的作用进行研究. 结果表明, 斜纹夜蛾危害能够明显诱导水稻茉莉酸合成途径的关键酶脂氧合酶和丙二烯氧化物合成酶基因的表达, 而且外源茉莉酸处理和斜纹夜蛾危害对脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶以及蛋白酶抑制剂等水稻虫害防御基因的表达有相同(似)的诱导作用, 表明斜纹夜蛾危害可能会诱导水稻启动茉莉酸信号传导途径, 从而使水稻产生诱导防御机制. 虽然机械损伤和褐飞虱危害对脂氧合酶基因的表达有一定诱导作用, 但对丙二烯氧化物合成酶的表达无明显影响. 然而, 褐飞虱危害对水稻防御基因PR-1a和几丁质酶等病原相关蛋白以及水杨酸生物合成途径的关键酶苯丙氨酸转氨酶有不同程度的诱导作用, 说明褐飞虱危害可能启动了水稻水杨酸或其他信号传导途径从而产生诱导防御作用.     

乙烯信号转导途径在褐飞虱诱导的水稻挥发物释放中的作用

以水稻褐飞虱Nilaparvata lugens及其卵期寄生蜂稻虱缨小蜂Anagrus nilaparvatae为研究对象, 通过分析褐飞虱为害后水稻乙烯释放量的变化以及乙烯、水稻挥发物和对寄生蜂引诱作用三者间的关系, 研究了乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中的作用. 结果表明, 在受褐飞虱为害后2~24 h, 受害稻株释放的乙烯浓度一直显著地高于未处理稻株; 利用乙烯利在酸性水溶液中释放的乙烯处理水稻后, 水稻能释放与褐飞虱为害株相类似的挥发物组成相, 并且两者表现出对寄生蜂相同的引诱活性; 在褐飞虱为害之前利用乙烯受体的抑制剂1-甲基环丙稀处理水稻, 可明显抑制褐飞虱诱导的大部分水稻挥发物组分, 并且对稻虱缨小蜂的引诱作用也受到抑制. 上述结果表明, 乙烯信号转导途径在褐飞虱为害诱导的水稻挥发物释放中是必需的.     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示,79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现,48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA,GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％,遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中,鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明,转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用,具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量,即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位

选用抗源来自药用野生稻（Oryza offcinalis Wall)的抗褐飞虱品系B5为父本,与感虫品种台中本地1号（TN1）杂交,随机选取167个F2单株构成定位群体。运用RFLP技术,采用集团分离分析法（bulked segregant analysis,BSA),对水稻抗褐飞虱基因进行分子标记定位。于第3和第4染色体找到与抗褐飞虱基因连锁的RFLP标记。构建了连锁标记附近区域的RFLP遗传连锁图谱,对这两个抗位点进行了QTL（quantitative trait locus)分析,将这两个抗褐飞虱基因分别定位于第3染色体的G1318和R1925,第4染色体的C820和S11182之间。与已报道的水稻抗褐飞虱基因位点相比较,表明这两个抗褐飞虱基因是新的抗性位点。抗褐飞虱基因新位点的发现和分子标记的建立,为水稻抗虫分子标记辅助育种和抗褐飞虱基因克隆打下了良好基础。     

栽培稻的紧穗野生稻抗褐飞虱主效基因的遗传定位

野生稻资源是水稻育种中获取有利外源基因的一个主要来源。紧穗野生稻（Oryza eichingeri,2n=24,CC)原产于非洲,具有高抗褐飞虱、白背飞虱和白叶枯病等多种有利性状。在紧穗野生稻与栽培稻（Oryza sativa,2n=24,AA)品种02428远缘杂交后代中,利用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP)和微卫星（simple sequence repeats,SSR) 等分子标记,对栽培稻背景下外源遗传物质的存在进行了跟踪鉴定,并对来自紧穗野生稻的抗褐飞虱基因进行了遗传分析和染色体定位。结果表明,紧穗野生稻的染色体片段已经易位到栽培稻中;抗褐飞虱性状由一对显性主效基因控制,位于第2染色体,在两个微卫星标记RM240和RM250之间,遗传距离分别为6．1和5．5cM,暂时定名为Bphl3(t)。该基因的发现和定位将有助于对水稻褐飞虱抗性的改良。     

虫害诱导的水稻挥发物对褐飞虱寄主选择行为的影响

用固相微萃取（SPME）、Tenax-TA吸附剂法结合气相色谱（GC）以及气相色谱－质谱联用（GC－MS）等技术，从不同诱导处理水稻植株（机械损伤、褐飞虱危害（具刺吸式口器）、斜纹夜蛾危害（具咀嚼式口器）及健康植株中分离鉴定了16种挥发性物质，不同处理水稻挥发物化学成分与含量有明显差别，受斜纹夜蛾伤害的水稻，其挥发物的含量与种类最多，其次为受褐飞虱伤害3和5d的植株，健康植株、机械损伤植株以及受褐飞虱伤害1和2d的水稻植株的挥发物种类少且含量低，在双向选择实验中，褐飞虱对健康植株、机械损伤植株以及褐 飞虱危害植株的定向选择行为无显著差异，斜纹夜蛾诱导的水稻挥发物对褐飞虱具有明显的拒避作用。     

β-葡萄糖苷酶处理与褐飞虱为害激活水稻类似的信号转导途径

已有研究表明, β-葡萄糖苷酶处理植株能诱导其产生与植食性昆虫为害类似的挥发物, 然而其诱导产生的机理至今尚不明确. 水杨酸、茉莉酸、乙烯和过氧化氢是植物诱导防御反应中发挥重要作用的信号分子. 为此, 本文对β-葡萄糖苷酶处理后水稻体内这4种信号分子的含量进行了测定, 并与褐飞虱为害稻株进行了比较, 以明确β-葡萄糖苷酶处理与褐飞虱为害是否激活了水稻类似的信号转导途径. 结果表明, 与相应的对照相比, 机械损伤并经β-葡萄糖苷酶处理能明显提高水稻水杨酸、乙烯和过氧化氢的浓度, 但却降低了茉莉酸的含量. β-葡萄糖苷酶对这些信号分子含量影响的总体趋势与褐飞虱为害的基本一致, 尽管两者所诱导的信号分子的绝对含量与时间动态存在一定差异, 表明β-葡萄糖苷酶处理能激活与褐飞虱为害相类似的水稻信号转导途径. 这一结果可以用于解释为什么两种处理能诱导水稻产生类似的挥发物并对稻虱缨小蜂具有同等的引诱作用.     

根据褐飞虱取食行为精细调控寄主水稻抗性的新机制

<正>植物害虫是农业生产的重要生物灾害因子,严重威胁作物生产安全.为了从寄主植物获取足够营养,植食性昆虫进化出了复杂多样的取食策略^[1].水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至全球最重要的粮食作物之一,常年遭受多种害虫为害.褐飞虱(Nilaparvata lugens St?l, BPH)是水稻单食性害虫,通过刺吸式口器吸食韧皮部汁液,对水稻造成直接危害;     

水稻肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达分析

用现有的OsCCR 基因片段筛选水稻核DNA文库, 获得了长为3045 bp的核DNA. 它包含4个内含子和5 个外显子, 推测的可读框长为337个氨基酸. OsCCR与其他植物中同类酶在氨基酸水平上有70%的相似性和30%的相同性, 含有保守的辅酶Ⅱ(NADP)结合位点及可能为该酶催化位点的特征序列. Northern杂交证实, 该基因产物广泛存在于水稻根、茎和叶等各组织中, 在茎中表达量较高. 组织原位杂交结果表明, OsCCR 基因在维管束及新生侧根中有强烈的表达信号, 与该基因编码的酶的木质素合成特性相吻合. OsCCR 基因的克隆、组织定位及生物化学方面的研究将有助于深入了解木质素形成的分子机理, 并为通过遗传工程的手段改善植物的机械性能以获得低木质素纸浆原料打下基础.     

水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因OsWIP1-2的诱导表达及其抑制活性

克隆了水稻的WIP1基因, 该基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族. RNA杂交实验结果显示该基因的表达受伤害和茉莉酮酸的诱导, 表明它在植物防御反应中起着重要的作用. 将此基因克隆到表达载体pET28a, 并在大肠杆菌中表达融合蛋白. 分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶为底物检测纯化的融合蛋白的抑制活性, 发现融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 但没有对胰蛋白酶的抑制活性; 同时发现融合蛋白C端的融合残基对蛋白酶抑制活性有重大影响, 具有C端(His)₆纯化标签的融合蛋白不具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 而有天然C端序列的融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这暗示了过长的C末端序列可能会影响WIP1蛋白的正确折叠. 蛋白酶抑制活性分析表明水稻Bowman-Birk抑制剂家族的成员可能在结构和功能上均发生了分化.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

晚稉多抗育种

培育对主要病虫害具抗性的水稻品种是近年来国际上水稻育种的重点。常见的病虫害有水稻稻瘟病、白叶枯病和褐飞虱等。在发病地区,对这些病虫不进行严格的药剂防治或防治失时的话,会导致严重减产甚至颗粒无收。在这些病虫常发地区推广抗性品种,     

水稻油体钙蛋白家族的进化及对干旱胁迫的响应性分析

油体钙蛋白不仅参与了油体的形成, 而且可能与植物耐受干旱胁迫有关. 目前对水稻中的油体钙蛋白的功能了解很少. 本文通过对水稻基因组数据库的序列搜索, 确定了水稻油体钙蛋白基因家族的6 个成员. 通过对这些基因的序列、结构和染色体位置分析, 表明水稻油体钙蛋白基因家族的扩增可能与片段复制和串联重复有关. 通过对这些基因与其他物种中的油体钙蛋白基因的系统进化分析及功能比较分析, 揭示了拟南芥和水稻中功能可能对应的成员. 为了确定与干旱胁迫响应相关的油体钙蛋白基因, 通过荧光定量PCR 检测了水稻油体钙蛋白家族在根、叶、花中的表达, 以及在这些组织中响应干旱胁迫的表达情况, 发现有3个基因成员在不同组织中受干旱胁迫的诱导, 为进一步对它们展开功能分析奠定了基础.     

棉花半胱氨酸蛋白酶基因的克隆和表达特性分析

根据不同植物编码半胱氨酸蛋白酶基因的保守序列, 设计兼并引物, 通过PCR 和RACE技术, 从辽棉9号衰老叶片中克隆了编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA, 其相应的基因命名为Ghcysp, 该基因序列的长度为1368 bp, 包含一个1034 bp的可读框, 编码344个氨基酸, 分子量为37.88 kD, 等电点为4.80. 数据分析结果显示, 该蛋白质由1个19个氨基酸残基组成的信号肽和3个酶活性催化反应中心组成, 是一个跨膜蛋白质, 位于液胞膜上. Ghcysp蛋白质与其他植物半胱氨酸蛋白酶的氨基酸同源性为67%~82%. Northern杂交结果表明, 在棉花衰老的根、脱落的花、下胚轴、胚珠和幼叶中, Ghcysp基因不表达, 在棉花的衰老叶片中Ghcysp基因表达量高.     

水稻三角颖突变体tri1的遗传分析与基因克隆

籽粒形状与大小是影响水稻产量和品质的重要因素. 本研究在经⁶⁰Co-γ射线辐射粳稻品种台北309的后代中分离获得一个三角颖突变体tri1(triangular hull 1). 与野生型相比, tri1籽粒颖壳呈三角形, 粒厚增加, 蛋白质含量升高, 株高和千粒重降低. 遗传分析表明, 该突变性状能稳定遗传, 受一对隐性核基因控制. 采用图位克隆法将目的基因精细定位于水稻第1染色体长臂上分子标记CHR0122与CH0127之间, 物理距离约47 kb, 并与分子标记CHR0119共分离. 在该区域内共有6个候选基因, 测序分析表明tri1突变体中一个释义基因OsMADS32的第3外显子内缺失了一个碱基A, 导致移码突变和翻译提前终止; RT-PCR分析表明, OsMADS32主要在水稻幼穗中表达, 在根、茎、叶和发育的种子等组织中的表达量极低, 说明OsMADS32基因与花的发育与关. 据此, 推测OsMADS32基因可能为TRI1的候选基因.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

通过共转化得到蛋白酶抑制剂II和δ-endotoxin的转基因烟草植株

植物抗虫基因工程近年来取得了较大进展,但是,昆虫对转基因植株B.t.杀虫蛋白产生抗性是一个值得重视的问题.与B.t.δ-endotoxin不同,蛋白酶抑制剂是来自于植物本身的一种蛋白质,它在植物组织中的积累主要有两种:第一种,它作为发育特定阶段的产物,存在于大多数植物的贮存器官中.第二种,在番茄等植物的叶片中,蛋白酶抑制剂Ⅰ和Ⅱ的积累受     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.