冷冻生殖细胞和组织用于保存实验动物遗传资源

动物生殖细胞(卵子、胚胎、精子)冷冻保存技术在畜牧生产、临床医学及生物技术等领域发挥了重要作用。利用超低温冷冻保存方法,将珍稀濒危动物和转基因动物生殖细胞保存起来,可实现动物种质资源的长期保存;但是精子和胚胎冷冻技术在疾病模型动物资源保存应用上仍存在许多问题。该文针对拟保存的动物品系生殖细胞和组织在低温冷冻保存中的实际问题及选择进行阐述,以期推进冷冻保存技术在动物资源保存中的应用。     

利用不同冷冻方法建立大鼠胚胎保种库的研究

采用程序冷冻、玻璃化冷冻和OPS法对大鼠囊胚进行了冷冻保存,探讨了不同冷冻方法对胚胎存活率的影响,解冻后存活率分别为82．4％,76．9％,85．7％;孵化率分别为47.1%,46.1%,53.6%。3种方法所得的囊胚存活率及孵化率均无显差异,均可作为对大鼠囊胚进行冷冻保存的有效方法,可用于胚胎建库。     

实验小鼠胚胎冷冻技术实验研究

本文在建立和引进实验小鼠超排卵技术、卵采集技术、胚胎输卵管移植技术的基础上 ,应用小鼠初期胚的快速冷冻复苏法对实验小鼠C5 7BL 6J、BDF1 、A wy及昆明种小鼠进行了初期胚的冷冻保存与仔鼠存活率的研究 ,并将冷冻复苏胚与非冷冻胚经移植后的生存率作了比较 ,均取得了重复性的结果 ,可望为实验小鼠胚胎种子库提供参考依据。     

人卵冷冻保存技术的进展(综述)

冷冻保存（Cryop～rvahon）是当前人类生殖工程中可以实施的技术之一。应用冷冻保存技术，人的早期胚胎解冻后又可以获得较好的存活率和妊娠率。但是，冻存的胚胎有时会因为其“父母”已成功怀孕而变为多余，如何处置这些已有“生命”的胚胎等问题常常引致一些道理伦理及法律的争议。如果直接冷冻保存卵子则可以避免这些问题。而且，卵子的冷冻保存还能够使那些在生育年龄前卵巢功能遭受损伤的病人有生育的机会。许多学者曾对卵子的冷冻保存进行过探索，所采用的冻存技术多从成功的胚胎冻存技术改良而来。然而，与胚胎冷冻保存的成功率相比…     

小鼠胚胎冷冻技术的研究进展

传统胚胎冷冻技术如OPS、冷冻环、冷冻帽、冷冻膜等,在胚胎复苏率和囊胚形成率、技术可行性、温度适用范围、冰冻和解冻速率等方面各具有其特定优缺点,在实际推广和应用中存在一定局限性。本文就新型微滴式玻璃化(Modified droplet vitrification,MDV)胚胎冷冻技术和高重量渗透摩尔浓度玻璃化(High osmolality vitrification,HOV)两种新型胚胎冷冻保存技术进行概述,并阐明胚胎冷冻保存及复苏发育过程中所受温度、饮食中植物雌激素、N-乙酰半胱苷酸等参数的影响。     

小鼠冷冻胚胎库

<正> 一引言 1972年Whittingham等人和Wilmut分别在超低温冷冻条件下冷冻保存小鼠胚胎获得成功。由于这项工作的理论意义和实用价值,国内外一些实验室相继开展了这项研究工作并相互交流各自的实验方法。出于对冷冻胚胎贮存的广泛兴趣 , 1974年9月荷兰肿瘤研究所的Otto Mhlbock博士在美国杰克逊实验室组织了一个专题讨论会。Mhlbock博士积极倡导运用冷冻胚胎技术保存小鼠遗传资源。与会代表对冷冻胚胎所涉及的各个方面,包括胚胎贮存期间电离辐射可能造成的危害及受体对冷冻胚胎恢复的     

山羊胚胎的体外发育及冷冻保存研究

采用体外培养的方法，对山羊２～８细胞胚进行培养以后将体外发育至囊胚的胚胎进行冷冻保存，以便探讨山羊早期胚的体外培养方法和冷冻方法对体外发育胚冷冻效果的影响。将胚胎分别放入Ｍ１９９、Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞和Ｍ１９９＋输卵管上皮细胞＋ＥＧＦ的培养液中进行培养，选取发育至囊胚期的胚胎分别以甘油和乙二醇为冷冻保护剂进行冷冻保存。结果体外培养胚的囊胚发育率在三个处理组中分别为１２．５％、７０．６％和７６．９％。使用Ｍ１９９处理组与添加输卵管上皮细胞、添加输卵管上皮细胞和ＥＧＦ的处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。冷冻解冻胚的形态正常率和发育率在以甘油和乙二醇为防冻剂的处理组中分别为６８．７、５８．３％和７８．６％、７２．８％。两组之间无明显差异，结果表明，采用与输卵管上皮细胞共同培养的方法能够提高山羊胚胎体外培养的发育率，以甘油和乙二醇为冷冻防冻剂均适合于山羊体外发育胚的冷冻保存，两者相比乙二醇的效果略优于甘油。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

小鼠胚胎低温生物学特性初探

NIH雌鼠腹腔注射5IU（83．35mol／s）的PMSG和5IU（83．35mol／s）HCG超排,一定发育时期的胚胎通过冲洗输卵管收集,在冷冻保护剂中的胚胎被吸入冷冻管后投入液氮中,以后用水浴解冻。用不同的冷冻保护剂冷冻保存胚胎后,体外培养能发育到囊胚的胚胎为具有功能活力的正常胚胎。平均发育率（X）和标准差（SD）根据表1－2中的基本数据所得。“A”代表冷冻管中的胚胎回收率,“B”代表回收的胚胎中发育到囊胚内的百分率。各组间的差异显著性通过t测验来评价。5种配方的保护剂CPI、Cpp、CP4、CPS和CPS用于冷冻保存多细胞期胚胎。3…     

保护剂浓度对第19期鸡胚原始生殖细胞存活率的影响

采用Ficoll密度梯度离心 ,提取第 19期 (孵化 72h)性腺中的原始生殖细胞 (PGCs) ,用不同浓度的冷冻保护液进行冷冻保存。复苏后的PGCs用台盼蓝染色检测其存活率 ,并进行体外培养。结果发现 :在同一浓度下 ,不同的冷冻保护液之间存在显著 (P <0 0 5 )或极显著 (P <0 0 1)差异。在同一种冷冻保护液下 ,不同的浓度之间存在显著(P <0 0 5 )或极显著 (P <0 0 1)差异 ,具体表现为冷冻保护液浓度越大 ,复苏后细胞的存活率越低。PGCs复苏后于体外培养 ,可增殖形成细胞克隆 ,并可传代培养     

细胞及玻璃化冷冻保护剂显微实验研究

利用低温冷冻显微实验平台,测定了DMSO和甘油两种保护剂的凝固点和玻璃化条件.采用4种不同的冷冻方案对SD大鼠的成骨细胞进行了低温冷冻保存研究.实验结果表明冷冻保护剂的凝固点温度随保护剂浓度和降温速率变化而变化,玻璃化的产生需要很高的保护剂浓度或很快的降温速率.保护剂的性能、冷冻和解冻程序及冻存时间是影响冷冻细胞比活的关键因素.所得结论对研究不同的细胞系、不同尺度组织的最佳低温冷冻保存方案具有指导意义.     

实验Beagle犬精液冷冻保存方法初探

实验比格犬是生物医学研究中较常用的实验动物。采用以精液冷冻保存为基础的人工授精技术将大大推动实验犬的繁殖育种工作,为此,本实验尝试用两种不同配方的冷冻保存液,三种不同的冷冻程序进行了比格犬精液的冷冻实验,结果比格犬精液经冷冻保存后,最高解冻存活率达７４％,解冻复苏率达到９７．３％,此方法用于犬的人工授精具有一定的可行性。     

冷冻保存对精子运动的影响

目的：观察精子运动状态,其中包括精子折断现象与冷冻损伤的关系。方法：对精液标本进行一步冷冻保存和分步冷冻保存,并用鉴别精子形态湿片法对冷冻前后精子运动状态及折断率进行评价。结果：冷冻保存复温后的精子活动率与冷冻前的精了活动率比较明显下降（P＜0．01）;含冷冻保护剂的实验组与不含冷冻保护剂的对照组比较,精子率呈显著性差异（P＜0．01）,精子折断率无显著性差异（P＞0．05）;一步冷冻和分步冷冻保存的精子之间活动率及折断率相比较,无显著性差异（P＞0．05）。结论：冷冻保存易造成精子活动率下降、运动形态异常,但不能显著地导致精子折断发生率增加。     

平衡方法及平衡和解冻温度对牛体外受精胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

以体外成熟、体外受精并体外发育的牛囊胚为实验材料进行玻璃化冷冻保存，分别探讨了防冻剂的平衡方法以及平衡和解冻温度对胚胎冷冻效果的影响．实验结果显示，在室温下（１８℃）以二步法或三步法添加防冻剂的冷冻效果，明显优于在４℃下，以二步法添加防冻剂的效果，其冷冻—解冻胚的发育率分别为６２．８％（５９／９４）、５３．１％（５２／９８）和１４．６％（１２／８２）（Ｐ＜０．０１）；另外，室温下以二步法玻璃化冷冻的胚胎，在２０℃水浴中解冻的发育率明显高于３７℃解冻的效果，６２．７％（３７／６２）、２６．２％（１６／６１）（Ｐ＜０．０１）．结果表明：体外成熟、体外受精的牛胚胎可以进行玻璃化冷冻保存，并能得到较高的培养存活率，在室温下，以二步法添加防冻剂，并于２０℃下解冻的玻璃化冷冻保存方法是一种快速、简便而有效的方法．     

DAP 玻璃化冷冻液对小鼠2-细胞胚胎的冷冻保存

摘要: 目的探索和优化小鼠2-细胞胚胎冷冻效果,建立小鼠胚胎冷冻保存技术以及超低温保存模型动物胚胎实验室所需的相关技术。方法选择3 个品系( C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － ) SPF 级4 周龄雌性小鼠,运用超数排卵、体外受精、玻璃化冷冻法,以及二细胞期胚胎复苏、体外培养等技术方法,观察上述实验效果。结果C57BL/6、ApoE － / －、NOS3 － / － 3 个品系小鼠超数排卵平均值分别为42. 98 个/只、27. 93 个/只、23. 11 个/只,体外受精2-细胞期胚胎率分别为68. 79%、32. 70%、23. 08 %,胚胎冷冻复苏后胚胎回收率72. 77%、80. 87%、83. 33%,存活率分别为56. 92%、54. 84%、70%,存活胚胎体外培养发育到囊胚比率分别为72. 37%、60. 78%、25%。结论选择4 周龄小鼠,按预定相同的技术方法做超数排卵、体外受精、胚胎冻存、胚胎复苏,呈现出较好效果,C57BL/6 小鼠优于基因工程小鼠,基本建立起小鼠2-细胞胚胎冷冻保存技术。     

小鼠胚胎干细胞系的建立及向雌性生殖细胞诱导的研究

胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能的两大特性.在体外产生功能性的配子需要模拟体内生殖细胞发育的多个步骤.而将胚胎干细胞诱导成生殖细胞对于生殖细胞特化的机制研究以及在辅助生殖领域的应用都有着重大的意义.建立了具有生殖系转移能力的雌性胚胎干细胞系,并在体外将其定向分化成原始生殖细胞样细胞,这些原始生殖细胞样细胞在体内可以发生减数分裂,证明了诱导的生殖细胞具有功能性.建立一个有效的生殖细胞诱导的平台,为以后研究体外配子的发生打下了坚实的基础.     

青虾精子超低温冷冻保存技术的研究

本文对青虾精子的超低温冷冻保存技术进行了研究.采用台盼兰染色法检测低温冷冻后青虾精子的活力,研究了3种稀释液(壬氏液,Kurokura extender,D-20)和3种冷冻保护剂(8%DMSO,12.5%甘油,10%甲醇)对青虾精子在超低温冷冻保存时的保护效果,以及不同保存时间后青虾精子活力的变化.结果表明,青虾精子以壬氏液为稀释液,添加8%DMSO作为抗冻保护剂,4℃平衡30 min,-20℃平衡15 min,-80℃平衡15 min后投入液氮中保存,解冻时将冷冻管浸入55℃水浴中10~15 s至半融取出自然解冻,精子能维持60%的存活力.本研究为青虾精子冷冻保存库的建立提供了实验依据和理论基础.     

绒山羊胚胎的体外培养,冷冻保存和移植的研究

采用体外培养和冷冻保存的方法将起排处理后的绒山羊２～８细胞期胚胎经体外在Ｍ１９９＋ＦＣＳ（对照组）、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＦＣＳ、Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＥＮＧＳ和，Ｍ１９９＋ＯＥＣ＋ＮＳＳ的培养基中分别进行培养以后，选取发育为桑椹胚和早期囊胚期胚胎分别以１０％Ｇｌｙ、１０％ＥＧ为防冻剂和玻璃化方法进行冷冻保存，并将用常规和玻璃化法冷冻保存的胚胎解冻后进行移植．结果表明，体外培养胚胎的囊胚的发育率在四个培养处理组中分别为１２．５％、７０．６％、８１．８％和７３．９％，对照组与添加ＯＥＣ处理组之间具有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），囊胚发育率在添加ＦＣＳ、ＥＮＧＳ和ＮＳＳ的实验组之间无明显差异．经冷冻保存的桑椹胚和早期囊胚的冷冻解冻胚的形态正常率在甘油、乙二醇和玻璃化三个冷冻处理组中分别为７５．０％、８６．７％和７５．０％，发育率分别为５８．３％、７８．８％和８０．０％．冷冻解冻胚的移植妊娠率在三个处理组中分别为５０％、７５％和５０％，产羔率分别为３０％、６８．８％和５０％．采用乙二醇冷冻绒山羊胚胎产生的效果优于甘油和玻璃化方法的冷冻效果。     

冷冻生命的奥秘

科学家已经做到了能够用冷冻保存的人体精子给卵子受精,还可以把胚胎冷冻保存起来,日后移植到人体子宫内,但是冷冻未受精的卵子的技术相对复杂得多,然而经过科学家几年的努力,最近终于取得了成功,从而使生命的冷冻成为完全的可能。 冷冻卵子技术为什么相对复杂,这得从卵子的细胞结构谈起。当科学家冷冻细胞或人体胚胎的时候,通常要用专门的化学物质取代     

中华鲟囊胚细胞的长期保存及其克隆胚胎发育观察

为保存濒危鱼类中华鲟种质资源,在0、-20、-80、-196℃4种不同的温度下对其囊胚细胞进行了长期保存试验,细胞存活期分别为10d、30d和2年,在液氮中(-196℃)保存2年后仍有60.7%存活率;用冷冻复苏后的细胞进行核移植,并对克隆胚胎的发育进行了观察.共移植417枚卵,获得2尾克隆幼鲟,成功率为0.48%,表明长期冷冻保存的囊胚细胞仍具有发育全能性,通过克隆技术能获得存活个体.此项技术为濒危物种的保护开辟了新途径.