中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCV—CHI）外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血

经PCR获得了中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCV－CHI）外壳蛋白（CP）基因，并克隆到pGEM-7Zf( ) 载体上，序列分析表明，TYLCV－CHI感染番茄或烟草时，CP基因的核苷酸序列发生变化，并且在烟草上随感染时间的延长，突变频率增高。连接到含有编码tRNAarg4基因argU的表达载体pSBET后，TYLCV－CHI CP基因在大肠杆菌中以包含体形式得到大量表达（约33ku)。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗TYLCV－CHI CP的抗血清。ELISA实验表明，该血清与抗原特异反应，血清效价为TYLCV－CHI CP的抗血清。ELISA实验表明，该血清与抗原特异反应，血清效价为1：3000。Western印迹实验还表明，该血清除了与感染TYLCV－CHI的番茄、烟草有特异免疫反应外，还与感染南瓜曲叶病、烟草曲叶病的叶片有免疫反应，表明这些病毒之间有明显的 血清学关系。     

中国番茄黄化曲叶病毒双向启动子的鉴定

以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)Y10分离物感染的烟草植物总DNA为模板,扩增病毒双向启动子片段,并分别以不同方向与gus基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.用土壤杆菌介导的方法将质粒载体导入本氏烟叶片细胞和植株茎部进行瞬时表达结果表明,互补链和病毒链启动子均能驱动gus基因表达,并且互补链启动子的活性高于病毒链启动子的活性.TYLCCNV伴随的卫星DNAβ分子的βC1的表达载体与启动子载体进行瞬时共表达时,βC1对病毒链和互补链启动子的活性均没有调节作用.     

柑橘衰退病毒柠檬分离物外壳蛋白基因原核表达及多抗血清制备

在云南发现的柑橘衰退病毒柠檬分离物对云南省德宏州的柠檬产业造成较大危害.通过用NdeⅠ和XhoⅠ对柑橘衰退病毒柠檬分离物外壳蛋白基因进行双酶切,定向插入到表达载体pET-28a中,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG在28℃下诱导6 h后,SDS-PAGE电泳显示,在25 kDa处有特异表达谱带,回收特异蛋白带作为抗原免疫家兔,制备出特异抗血清.间接ELISA测得效价为1∶3000,并且与CTV具有良好的特异性反应.     

芜菁皱缩病毒P38蛋白的原核表达及抗血清的制备

从感染芜菁皱缩病毒(TCV)的拟南芥中提取总RNA,通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到TCV的外壳蛋白基因P38.在目的基因ORF框两边引入酶切位点BamHⅠ和SacⅠ,并连接到表达载体pET30-a上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,37℃经0.5mM/L IPTG诱导6h后获得了分子量约为48kD的融合蛋白.经Ni-NTA纯化目的蛋白,注射大白兔制备抗血清.Western blot结果表明制备好的抗血清能成功检测感染TCV的拟南芥.     

中国番茄黄化曲叶病毒在云南的发生分布及其遗传多样性

对云南普遍发生的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)进行分子鉴定.结果发现中国番茄黄化曲叶病毒在云南的发生非常广泛,其发生、分布与地理生态、气候类型有关,主要集中在滇中南的热带、亚热带气候类型地区.共获得20个TYLCCNV分离物的病毒全基因组DNA-A,和已报道的中国番茄黄化曲叶病毒云南分离物进行同源性比较,它们之间的同源性在89.2%~97.4%之间.同源性比较发现中国番茄黄化曲叶病毒DNA-A具有明显的地理分布差异,地理和气候接近的地区同源性越接近.     

一种非洲番茄黄化曲叶病毒DNA的克隆

用ＰＣＲ获得了非洲塞内加尔番茄黄化曲叶病毒（ＴＹＬＣＶ－ＳＥＮ）的全长ＤＮＡＡ，并进行了克隆和部分序列分析，ＤＮＡ序列分析的序列并１３５９ｂｐ，包括外壳蛋白基因，ＡＶ１基因，基因间区（ＩＲ）及部分复制酶基因，计算机分析显示：ＴＹＬＣＶ－ＳＥＮ与其他亚组ＩＩＩ及生理病毒相比，外壳蛋白氨基酸同源性为６７％～８３．４％，ＡＶ１基物氨基酸同源性为６１％～８４％，ＩＲ最大同源性为６０％～６８％，且与非洲和中     

侵染番茄的中国番茄黄化曲叶病毒致病性相关分子的遗传多样性

对云南番茄中的中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)不同分离物的致病性相关分子DNAβ进行PCR扩增和克隆.全序列比较分析发现滇西北和滇南各分离物DNAβ同源率较高而且进化关系较近,滇西南与之差异较大.获得的16个DNAβ分离物具有一定的地理分布差异.     

感染番茄抗病品种的番茄黄化曲叶病毒的基因变异分析

近几年来,生产中发现一些番茄抗病品种在不同环境条件下或应用几年后出现感病现象。为了解不同抗病品种中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)基因变异的情况,对5个感染TYLCV的番茄抗病品种进行了TYLCV全长基因克隆和序列测定。扩增结果显示,5个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781 bp,且均编码6个功能蛋白。基因组序列比较发现,这5个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到99%以上;通过功能蛋白比对发现,复制增强因子AC3蛋白存在变异,同世界各地报道的TYLCV-Israel株系典型分离物的AC3蛋白存在7处氨基酸差异的位点。分析结果表明,这五个病毒分离物均属于TYLCV-Israel株系,其AC3蛋白的氨基酸序列变异程度均不显著,并没有产生新的病毒株系。     

伴随中国番茄黄化曲叶病毒的卫星DNAβ在本氏烟中的种群变异

采用根癌土壤杆菌介导接种和分子克隆技术,分析中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellowleaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物(Y10)的伴随卫星DNAβ(Y10β)在本氏烟中的种群变异.结果显示表明:本氏烟中Y10β种群所有克隆均发生不同程度的变异,在接种60 d及120 d后其种群突变频率分别为2.48×10-3和2.54×10-3,表明该卫星DNAβ在同一寄主体内的侵染时间对其种群变异水平没有明显影响;Y10β种群的碱基突变位点主要分布于DNAβ的富A(A-rich)区,在卫星共同区(SCR)内碱基突变位点最少;其碱基突变类型以A→G,G→A,T→C突变及碱基G缺失等突变类型的比例较高,并且在A-rich区内出现多个克隆在同一核苷酸位点发生相同突变的现象.     

番茄黄化曲叶病毒病抗性材料的筛选鉴定

 为评估新培育番茄栽培品种对番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的抗性水平,更全面地了解这些品种的抗病性差异,以金棚1 号和金曼为感病对照,采用带毒烟粉虱自然传毒方式,对各品种的发病时间、发病率及病情指数等参数进行比较,结合PCR 及ELISA 对TYLCV 的检测结果,综合分析了18 个番茄品种对番茄黄化曲叶病毒的抗病性。结果表明,不同品种对TYLCV 的抗性差异较大。金棚1 号和金曼两份材料发病率都达到100%,病情指数在65.2 以上,属于典型的感病品种;秋光15-6、PC-88 和秋光69 号3 份材料发病率和病情指数均为0,属于抗性较高的品种;其他13 份材料的发病率和病情指数分别在5.6％～45.2%和2.6～18.0 之间,分别表现了不同程度的抗、耐病水平。     

马铃薯卷叶病毒陕西分离物外壳蛋白(CP)的生物信息学分析

目的分析预测马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白的理化性质及结构。方法应用DNA-MAN软件、ExPASy中的ProtParam工具,SignalP,LipoP程序,TMHMM,PSIPRED和3D-PSSM等方法,分析PLRV.CP的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亲疏水性、可溶性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、保守区域、三级结构等。结果陕西PLRV.CP,与已报道的PLRV.CP高度同源。蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,不属分泌蛋白,是可溶的亲水性蛋白。二级结构主要为折叠和无规则卷曲,不含转角。三级结构保守区预测表明,该蛋白属于黄化病毒属外壳蛋白成员。结论对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白的生物信息学分析为进一步研究其功能、探索抗病途径奠定了基础。     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

番茄黄化曲叶病毒北京分离物的全基因组序列测定及进化分析

番茄黄化曲叶病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)在我国危害日益严重.为了对该病进行深入有效的了解,根据已知的番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)基因组DNA-A序列的保守区段,设计两对背向引物;针对北京地区的3个TYLCV分离物进行分子鉴定.结果显示该分离物为单组分病毒,不含DNA-B和卫星DNA-β,是TYLCV的2个新分离物.TYLCV-BJ1与BJ2基因组全长分别为2781bp和2779bp,同源性为99.8%,都编码6个开放阅读框.对TYLCV的分子进化分析表明,国内现已发现的TYLCV株系亲缘关系都很接近,同源性在97.1~99.9%,属于以色列TYLCV-IL株系进化下的一个近代分支.从全基因组和各基因的逐个比对结果看,TYLCV的AV1和AV2保守性最高,其次是AC2和AC3.当TYLCV-Mld进化成TYLCV-IL时,AC1和AV4基因发生了较大的变化,IR区的同源性更是从小于70%上升到94.3%.国内的TYLCV株系分成2个亚群,但在地理分布上没有形成严格的区域限定,北京分离物属于CN I亚群.     

番茄黄化曲叶病毒自然种群的分子变异和进化研究

研究目的：创新要点：研究方法：重要结论：2006年我国上海首次发现番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）,随后TYLCV迅速蔓延至全国13个省份和自治区。本研究分析了2006至2010年期间TYLCV在我国首发地上海市的分子变异规律。本研究持续五年追踪田间TYLCV,分析TYLCV的全长基因组序列、分子变异及种群遗传结构,为防控TYLCV提供理论依据。2006至2010年从上海采集了26个TYLCV的分离物,利用高保真性的滚环扩增技术获得TYLCV分离物的全长基因组。应用MEGA5等生物信息学软件分析TYLCV的分子变异。TYLCV自然种群具有与RNA病毒相似的突变率,以基因间隔区的分子变异最大,平均突变率为4．81×10-3（见图2和表2）。TYLCV的大部分基因都处于负向选择,但包含在c1开放阅读框内的C4,却与c1承受着不同的选择压而处于正向选择（见图3和表6）。     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

人泡沫病毒GAG、ENV蛋白的原核表达、抗血清制备及鉴定

构建了HFV的GAG和ENV蛋白原核表达载体pET-32a-gag和pET-32a-env,转化E.coli BL21Star(DE3)后用IPTG诱导出高水平的GAG、ENV融合蛋白表达.以融合蛋白免疫新西兰兔制备了GAG和ENV抗血清.Western Blot检测表明,抗血清可以识别原核表达的GAG和ENV蛋白,说明抗血清具有较好的特异性.结合Western Blot和间接免疫荧光实验,表明抗血清可以检测到病毒表达的GAG和ENV蛋白.     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal I和Rst I酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒相互作用的寄主因子、克隆寄主因子，推测其种类和功能打下基础。     

AtPCS1基因的原核表达及多抗血清的制备

利用RT-PCR扩增拟南芥螯合肽合成酶(AtPCS1)基因全序列,构建原核表达载体pET28a-AtPCS1并测序.将该载体转化大肠杆菌BL21,用0.75mmol/LIPTG诱导融合蛋白AtPCS1-His的表达,纯化该融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠,ELISA法测定抗血清的效价可达1:2000.抗血清与融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明:制备的抗血清具有较高的活性和特异性.