石河子一串红花叶病病原的分子鉴定

为了防治石河子一串红花叶病,采用提取dsRNA/RNA、RT-PCR、克隆和序列分析对病原进行了检测鉴定。结果表明:从表现花叶的S4分离物中提取dsRNA,得到大小约4700和6300 bp的片段,以此dsRNA为模板,用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物进行RT-PCR,扩增得到1条约390 bp片段特异性条带,序列测定该片段大小为391nt,blast比对分析与蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV2)的同源性最高,表明S4分离物为BBWV2。RNA1基因组全序列测定及分析结果表明,基因组大小为5957nt(不含poly A),仅编码1个开放阅读框(ORF),与已报道BBWV2的RNA1序列同源性为78.4%-100.0%。     

Nucleotide sequence of RNA2 and polyprotein processing sites of a Chinese isolate of broad bean wilt virus 2

RNA2 of broad bean wilt virus 2 (BBWV2) isolate B935 is composed of 3601 nucleotide (nt) residues, exclusive of the polyadenylate at the 3' end. Only one of the six possible reading frames has a long open reading frame, which extends from nt 231 to nt 3428 in the polarity of encapsidated RNA, and encodes a polyprotein of 119 kD. The N-terminus of the large coat protein (LCP) is located at 599 nt and the small coat protein (SCP) at 197 nl from the C-terminus of the 119 kD protein, which suggests that the coat proteins are released from the polyprotein by cleavages of a glulamine-glycine (Q-G) and a glutamine-alanine (Q-A) bond respectively. The sequence comparison of B935 with fabaviruses shows that B935 has very high sequence homology with other BBWV2 isolates and with patchoul' mild mosaic virus, but has lower homology with BBWV1 isolates. B935 has a similar genomic organization, but a low sequence homology to RNA2 molecules of comoviruses and nepoviruses.     

侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT—PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RTPCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2（BBWV2）基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNAl和RNA2具有高的序列同源性,分别为76．6％～94％和76．9％～94．1％,而与BBWVl的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种（品系）加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53．3％,并且供试20品种（品系）均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。     

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ宁夏分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

用酶联免疫吸附法对宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种进行卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ)的测定,检测率为37.1%,与田间自然发病率调查结果基本一致.设计GLRaVⅢ外壳蛋白(CP)基因序列引物对,进行RT-PCR扩增,获得1.1 kb的特异片段.其中,CP基因长942 bp,推导的编码蛋白含有313个氨基酸.通过对GLRaVⅢCP基因同源性比较,结果表明,GLRaVⅢ宁夏分离物的CP基因与四川分离物SL-10 CP基因的亲缘关系最近,核苷酸和所编码的氨基酸序列同源性分别为98.8%和98.1%;与巴西分离物PET-4和智利分离物C1-817 CP基因亲缘关系较远,核苷酸序列同源性低于95.0%,所编码的氨基酸序列同源性低于97.0%,认为GLRaVⅢ株系间的CP基因存在差异.     

CGSIV病毒ORF22R序列分析,克隆及大肠杆菌表达

中国大鲵虹彩病毒是近年来造成驯养大鲵大规模的发病及死亡的病原体之一.以病毒基因组为模板,分离了ORF22R DNA序列.蛋白氨基酸序列信息分析结果表明中国大鲵虹彩病毒与蛙病毒属中类两栖类蛙病毒组的成员有很高的同源性,达到95.9%~98.2%;而与蛙病毒属类GIV病毒组成员的同源性相对较低,为31.7%;与淋巴囊肿病毒属的成员的同源性最低,只有16%左右.将PCR技术分离的ORF22R DNA序列克隆至原核表达质粒pET22b.重组质粒pET22b-ORF22R转化于Rosetta大肠杆菌菌,经IPTG诱导,表达重组蛋白.镍柱纯化后SDSPAGE检测ORF22R蛋白分子量为65 kD,CGSIV ORF22R蛋白原核表达成功.     

北疆地区辣椒病毒病毒源种类分离鉴定的初报

1990～1992年,从石河子、昌吉、阜康、乌鲁木齐及哈密等地采集了不同症状的辣椒病毒病标样75份。通过指示植物3次单斑分离,纯化后获8个病毒分离物,编号分别为P—91—5、P—91—7、P—91—8、P—91—10、P—89—2、P—89—27、P—90—3及P—90—4。上述分离物经病毒的寄生范围、鉴别寄主反应、传毒介体及传播方式、体外稳定性、电镜粒体观察、血清学反应及理化性质的测定,鉴定出6种病毒:黄瓜花叶病毒(CMV)占28％、烟草花叶病毒(TMV)占24.7％、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)占5.0％、马铃薯X病毒(PVX)占4.3％、马铃薯Y病毒(PVY)占2.7％、烟草花叶病毒组一新成员病毒(暂定为C_aMV)占21.3％。还有两种未知病毒分别占13.2％及3％。研究表明,在北疆地区辣椒病毒病的主要毒源是CMV、TMV及C_aMV,但对辣椒危害性最大的是TMV及BBWV,导致辣椒萎蔫、坏死及顶枯。     

与含卫星DNA的烟草曲茎病毒伴随的nanovirus类DNA分子鉴定

利用已报道的两种粉虱传双生病毒DNA1分子的全长特异性引物进行PCR扩增,在含有卫星DNAβ的烟草曲茎病毒(TbCSV)Y35和Y115分离物中扩增到一种单链环状DNA小分子(命名为DNA1),而在不含有卫星DNAβ的TbCSV Y1和Y121分离物中没有扩增到DNA1分子. 免疫捕获PCR表明DNA1分子包裹在双生病毒粒子中. Southern blot检测进一步证实仅在含卫星DNAβ的TbCSV Y35和Y115分离物中存在DNA1分子. 序列分析表明,Y35 和Y115 DNA1序列全长分别为1367和1368?nt,各有一个较保守的开放阅读框(ORF),编码类似nanovirus 的Rep蛋白. 两个DNA1分子与辅助病毒DNA-A序列无同源性. Y35和Y115 DNA1全长核苷酸序列同源性为92%,ORF编码的氨基酸同源性为96%,而与已报道的胜红蓟黄脉病毒和木尔坦棉花曲叶病毒的DNA1的核苷酸序列同源性为70%～79%,氨基酸序列同源性为87%～90%. 将DNA1与nanoviruses DNA比较后发现,两者有较远的亲缘关系.     

芜菁花叶病毒衣壳蛋白亚基分子量测定及其在低浓度SDS中的解聚现象

一、引言芜菁花叶病毒(T_PMV)发现于1921年,但其研究进展甚慢.究其原因主要是该病毒在分离纯化过程中极易集聚,得率低,病毒本身很不稳定.到七十年代,仍未找到圆满解决芜菁花叶病毒在纯化过程中颗粒间极易发生的集聚现象和提高得率的有效方法.尽管如此,国外仍有一些关于芜菁花叶病毒衣壳蛋白亚基的氨基酸组分和核酸碱基比的研究     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

芜菁花叶病毒四川分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

从四川省3个蔬菜基地感病的甘蓝、花菜、萝卜、叶芥菜分离到芜菁花叶病毒6个分离物.利用 RT-PCR克隆了这6个分离物的外壳蛋白基因(CP), 测定了它们的核苷酸序列并进行了序列分析. 结果表明,6个分离物的 CP基因均为864个碱基,核苷酸序列同源性较高, 达 97.0%～100%;它们与 world-B组分离物的同源性最高,达 92.1%～100%;与 basal-B组分离物的同源性最低,仅 87.6%～90.2%. 基于 TuMV的 CP基因核苷酸序列的分子进化树显示,TuMV分离物可分为4组,本研究所分离到的6个 TuMV四川分离物属于第四组,即 world-B组.     

云南3个不同地区水稻矮缩病毒S8片段的序列分析

用RT-PCR方法从云南昆明、玉溪和陆良3个地区的水稻样品中扩增到水稻矮缩病毒S8全长片段,核苷酸测定及序列分析表明,水稻矮缩病毒云南昆明、玉溪及陆良分离物S8片段全长均为1356 bp,含一个1266 bp的ORF,编码421个氨基酸.核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4个中国分离物S8片段之间的核苷酸同源性为97.9%,其编码的氨基酸同源性为98.6%;4个中国分离物与日本分离物的S8片段核苷酸同源性和氨基酸相似性分别为94.7%和98.1%.昆明、陆良、玉溪和福建分离物应属同一株系,而日本分离物应属另一株系.     

金鱼蛋白磷酸酶2A-B"家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基B"家族中γ基因(G5PR)cDNA全序列和α基因(PR130)cDNA部分序列.结果显示γ基因cDNA全长1885 bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质.而α基因cDNA长1781 bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系α亚基的部分蛋白序列.它们与已知其他物种对应的B"家族蛋白质均有着很高的同源性.结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B"家族成员共有的两个EF-HAND结构域.用RT-PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平.结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富.与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强.据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用.此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能.     

豇豆病毒病的鉴定

1983年9月,从新疆石河子豇豆病毒病植株上分离到1株病毒分离物Cp—1。汁液摩擦接种试验的结果证明,它可以侵染三种豆科植物和二种藜科植物。在豇豆上引起系统花叶,叶片皱缩,下卷并有疱疹等症状;在绿豆上表现为局部病斑。体外抗性测定,失毒温度为55—60℃,稀释限点为10~(-3)—10~(-4)。体外保毒期3—4天。Cp—1汁液易摩擦接种,桃蚜、棉黑蚜均可传毒,可通过种子传毒,种传率为10.6％。病毒粒体线条状,大小为12—5×700—750纤米。病株叶片细胞内有风轮状内含体。该分离物与豇豆蚜传花叶病毒(CA-BMV)的抗血清形成明显的沉淀线。根据以上性状,分离物Cp—1属于马铃薯y病毒组的豇豆蚜传花叶病毒。在新疆各地采取21个标样,经血清学和寄主范围测定,有13个标样属该病毒,约占62％。说明豇豆蚜传花叶病毒在新疆种植的豇豆上是普遍存在的。     

貉源犬瘟热病毒昌黎株的分离鉴定及其H基因序列分析

为了解河北省毛皮动物犬瘟热病毒的流行及遗传变异情况,采用Vero细胞从具有犬瘟热临床症状的貉肺脏样品中分离出一株病毒,经过间接免疫荧光、RT-PCR和动物回归试验等鉴定,分离的病毒为犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV CL14株。对该病毒血凝蛋白H基因进行克隆测序和遗传进化分析表明,CDV CL14分离株属于Asia-1型,为我国的流行毒株,H基因核苷酸及其编码氨基酸序列与我国流行毒株有较高的同源性,其中核苷酸同源性最高的为He B(09)1株和LN-13-1株,同源性同为99.1%,而氨基酸同源性最高的为LN-13-1株,同源性为99.3%。     

感染番茄抗病品种的番茄黄化曲叶病毒的基因变异分析

近几年来,生产中发现一些番茄抗病品种在不同环境条件下或应用几年后出现感病现象。为了解不同抗病品种中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)基因变异的情况,对5个感染TYLCV的番茄抗病品种进行了TYLCV全长基因克隆和序列测定。扩增结果显示,5个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781 bp,且均编码6个功能蛋白。基因组序列比较发现,这5个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到99%以上;通过功能蛋白比对发现,复制增强因子AC3蛋白存在变异,同世界各地报道的TYLCV-Israel株系典型分离物的AC3蛋白存在7处氨基酸差异的位点。分析结果表明,这五个病毒分离物均属于TYLCV-Israel株系,其AC3蛋白的氨基酸序列变异程度均不显著,并没有产生新的病毒株系。     

感染番茄抗病品种的番茄黄化曲叶病毒的基因变异

近几年来,生产中发现一些番茄抗病品种在不同环境条件下或应用几年后出现感病现象。为了解不同抗病品种中番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)基因变异的情况,对5个感染TYLCV的番茄抗病品种进行了TYLCV全长基因克隆和序列测定。扩增结果显示,5个样品携带的TYLCV基因组长度均为2 781 bp,且均编码6个功能蛋白。基因组序列比较发现,这5个分离物与TYLCV-Israel株系同源性达到99%以上;通过功能蛋白比对发现,复制增强因子AC3蛋白存在变异,同世界各地报道的TYLCV-Israel株系典型分离物的AC3蛋白存在7处氨基酸差异的位点。分析结果表明,这五个病毒分离物均属于TYLCV-Israel株系,其AC3蛋白的氨基酸序列变异程度均不显著,并没有产生新的病毒株系。     

大熊猫核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的cDNA克隆及序列分析

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料,成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫L30亚基基因的表达序列长为388bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,并含有6个功能位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠有很高的相似性,其表达序列同源性分别为93.97%,96.26%,89.66%和89.94%,其编码的氨基酸序列同源性分别为99.13%,98.26%,99.13%,99.13%,且其蛋白质的高级结构相似性也很高.     

新疆辣椒上一种球状病毒的鉴定

1990年,从辣椒上分离到一个病毒分离物,代号P—9003。人工接种可侵染6科14种植物,回接辣椒产生轻微花叶,不被蚜虫传播,可通过汁液摩擦传染。致死温度80—85℃,稀释限点为10~(-7),体外保活期18天左右。病毒粒体球状,密集时呈多角形,直径33—34nm。该病毒在寄主体内浓度较大,通过差速离心和蔗糖梯度离心容易获得较高浓度的纯化病毒,病毒衣壳蛋白分子量为一个组份,约为27500道尔顿。核酸分子量为三组份,分子量分别为1.24,0.55和0.37×10~6道尔顿。与黄瓜花叶病毒(CMV),蚕豆萎蔫病毒(BBWV),烟草坏死病毒(TNV),烟草环斑病毒(TRSV),香石竹环斑病毒(CRSV)的抗血清不发生反应。与番茄黑环病毒(TBRV)抗血清产生微弱的沉淀线。衣壳蛋白分子由211个氨基酸组成。根据多项测定结果认为,虽P—9003与TBRV抗血清有微弱反应,但其它各项特性与TBRV相差甚远,为非特异反应。P—9003的核酸和蛋白分子量与已知的几个球状病毒组的数据均不相符,因此认为P9003为一种木报导过的球状病毒,暂定名为辣椒轻花叶病毒(PepperMild Mosaic Virus,PMMV)。     

黄瓜花叶病毒小青菜分离物RNA3全长序列分析

对侵染十字花科小青菜的黄瓜花叶病毒YN分离物（CMV-YN）RNA3进行全长克隆和序列分析．CMV-YNRNA3全长2220nt，分别编码279个氨基酸的3a蛋白和218个氨基酸的CP．序列同源性比较结果如下；CMV-YNRNA3核苷酸及其编码蛋白的氨基酸序列与亚组IA株系CMV-Fny、亚组IB株系CMV-Nt9、亚组Ⅱ株系CMV-Q的同源性，RNA3序列分别为92．7％、96．7％、74．2％，3a蛋白氨基酸序列分别为96．4％、98．6％、83．2％，CP氨基酸序列分别为97．7％、98．2％、83．1％．该结果表明CMV-YN与亚组IB株系CMV-Nt9的同源关系更密切．对CP核苷酸序列的系统进化树分析表明：CMV-YN归属于亚组IB，本研究为首次报道侵染我国十字花科植物的CMV基因组序列．