肺癌组织中AKAP12启动子区域甲基化状态研究

目的:探讨肺癌组织中A激酶锚定蛋白12(AKAP12)基因启动子区域异常甲基化情况及其临床意义。方法:用甲基化特异性PCR(MSP)检测肺癌组织中AKAP12基因启动子区域Cp G岛甲基化状态,分析其与肺癌患者病理参数的关系;采用亚硫酸盐测序法对包含17个Cp G岛的选定片段发生甲基化的频率进行分析。结果:通过甲基化特异性PCR(MSP)检测50例患者肺癌标本,32份标本(64.0%)被检测出AKAP12基因启动子区域存在异常甲基化。AKAP12基因甲基化水平在不同年龄组以及性别组中的差异无统计学意义(P0.05),而与肺癌的病理分期和分化程度的差异有显著统计学意义(P0.05)。不同标本在17个Cp G位点中发生甲基化的情况并不相同,其中7、9、10、11和13五个位点出现甲基化的比例较其余位点明显增高(P0.05)。结论:AKAP12启动子甲基化改变与肺癌恶性程度及肿瘤进展相关,7、9、10、11和13五个位点出现异常甲基化频率较高可能提示其对AKAP12正常表达具有一定的调控作用。     

CMV启动子克隆及其在植物体内的表达

根据细胞肥大病毒CMV启动子基因序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPCG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过CMV启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:CMV启动子可启动GUS在植物体内的表达,其表达活性相当于2×35S启动子的(80.4±26.6)％.     

杆状病毒AcMNPVie0/ie1启动子区域甲基化对自身调控作用的影响

对杆状病毒ie0/ie1启动子区域甲基化测序和甲基化特异性PCR,发现ie0区域甲基化程度较高,且随着感染过程发生变化,在感染后8h有明显下降.为了研究启动子区域内甲基化对其活性及表达调控的影响,构建了表达AcMNPV极早期蛋白IE0和IE1的质粒p402-ie1、p402-ie0M-A及报告质粒pie0p-luc、pie1p-luc,采用体外甲基化的方式,研究DNA甲基化对IE0、IE1调控自身启动子作用的影响.结果证实ie0p受IE0蛋白激活,而受到IE1蛋白抑制,发现DNA甲基化极大降低ie0p、ie1p活性.验证了IE0、IE1蛋白对于ie1p的激活作用,而甲基化后IE1/IE0对其激活作用依然保持.不同比例的p402-ie1/p402-ie0M-A转染实验,发现在IE0IE1时,甲基化能够逆转IE0/IE1对于ie0p的调控作用.这些结果表明,DNA甲基化状态可以影响杆状病毒IE0和IE1蛋白对ie0启动子对基因表达的调控.     

启动子对外源基因在转基因植物中表达的影响

将来自ｐＢＩ１２１质粒的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子片段插入到ｐＢＩ１２１的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与ＧＵＳ基因之间，构建了串联的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子载体ｐＬＢ３８．通过三亲交配，将ｐＢＩ１２１及ｐＬＢ３８分别转移到含ｐＧｖ３８５０的农杆菌中，成为适合本研究的双元载体。以叶圆盘转化法将外源基因转入烟草，获得了２种转基因植株。经ＤＮＡ分子杂交、ＮＰＴⅡ点分析、ＧＵＳ荧光定性及定量分析，证明外源基因已整合进烟草基因组并获得表达。ｐＬＢ３８的ＧＵＳ表达量为ｎＢｌ１２１的３～４倍，这表明启动子数目的不同会直接影响其启动基因的表达水平。     

猪生长激素基因启动子区的序列变异研究

采用聚合酶链式反应(PCR)及PCR产物直接序列分析方法，对猪生长激素基因(pGH)5’-侧翼区(启动子区)序列的遗传变异进行研究，共分析了6头临高猪、3头玉山黑猪和5头蓝塘猪．结果表明：在猪生长激素基因启动区，共有10处碱基替换，它们分别位于：72位C→T，238位G→T，343位A→G，274位A→G，721位G→C。722位T→C，723位G→C，728位C→T，784位G→C，787位G→T．2处碱基插入，依次是180位插入碱基G。416位插入碱基C．新发现了3处碱基置换，分别是721位G→C，722位T→C，723位G→C和1处碱基插入，416位插入碱基C．     

基因功能区域的DNA甲基化分析

基于人类9种细胞系和15种组织的单碱基精度的甲基化数据,计算了基因范围六个功能区域(转录起始区域、第一外显子、中间外显子、最后外显子、内含子和转录终止区域)的甲基化水平,分析了各功能区域甲基化的分布.采用离散增量和欧式距离两类参数分别计算了细胞系和组织间的基因的甲基化差异,并对具有较高差异水平的前20个基因在六类细胞系的表达进行了分析.     

穿俊质粒pGFP—1与CMV启动子重组体的构建

构建并筛选出能在哺乳细胞表达的重组质粒。方法：以含ＧＦＰｃＤＮＡ报告者基因的穿梭质粒ｐＧＦＰ－１ｏ ｆａ ｗｓｇ ，ｔｆｑｐｅｔ ｗ ａｎｄ ｘｌｅｑｕｇｇｘｙｎｋ ｆｃｌ ｂｂ ，ｅｓ ｅｔ ａｄｌｄｔｇｊ ｘｅｇ ｒｆｓｙｓｑ ｖｆｈｐｔｇｊ ｘｅｇ ｒｆｍ ｏｕｇ     

SFRP1基因启动子区甲基化与宫颈癌及癌前病变的相关性研究

应用MassARRAY DNA甲基化定量分析方法检测58例宫颈癌组织、57例CIN2/3组织、36例CIN1组织及28例正常对照组织中SFRP1基因启动子区各CpG位点甲基化,探讨SFRP1基因启动子区甲基化与宫颈癌演进及与HPV16感染的相关性。结果显示:2110个CpG单位中甲基化率低于30%的CpG单位1612个,占总数的76.4%;甲基化率大于80%的CpG单位为4.4%,多分布于CIN2/3和宫颈癌组织之中。其中SFRP1基因启动子区CpG12.13和CpG18位点的甲基化率宫颈癌组高于对照、CIN1和CIN2/3组,差异具有统计学意义(P0.05)。CpG12.13和CpG18位点甲基化率与HPV16感染无相关性(P0.05)。提示SFRP1基因在CpG12.13和CpG18位点上高甲基化可能与宫颈癌的演进相关。     

鱼类转基因早期胚胎细胞的核移植研究

像许多转基因高等生物一样,用显微注射方法研制的转基因鱼均为转植基因嵌合体,培育纯合转基因品系已成为研究者们向往和追求的目标.以澎泽鲫(Carassius auratus,Pengze var.)和黄河鲤(Cyprinus carpio,Huanghe var.)为实验材料,以转基因囊胚细胞核或原肠胚细胞核为供体,进行了细胞核移植.检测了转植基因在所获得的移核胚胎和5尾澎泽鲫移核鱼及1尾黄河鲤移核鱼中的存在状况,分析了用转基因早期胚胎细胞核移植方法研制纯合转基因鱼的可能性.     

牙龈癌PTEN基因启动子区甲基化状态与鳞癌分级的分析研究

探讨第10号染色体丢失性的磷酸酶——张力蛋白同源基因(PTEN)启动子甲基化水平和蛋白表达水平与牙龈癌癌症细胞分化程度的关系。用甲基化特异性PCR法检测牙龈癌组织中PTEN基因启动子甲基化的状态,免疫组化法检测石蜡组织中PTEN的蛋白表达情况。结果牙龈癌组织中发生PTEN基因甲基化的频率为56.67%,其中高分化组甲基化频率为20%,中分化组为50%,低分化组为100%,组间差异具有统计学意义(P0.05),PTEN甲基化频率与其细胞分化程度密切相关。说明牙龈癌中PTEN基因可出现启动子甲基化,且低分化组牙龈癌PTEN甲基化频率更高,同时细胞内PTEN蛋白表达显著下调甚至缺失,为牙龈癌的靶向治疗提供线索。     

甲状腺乳头状癌RASSF1A启动子异常甲基化的检测

为了研究甲状腺乳头状癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态,探讨其甲基化与临床参数之间的关系,运用甲基化特异性PCR(MSP)技术,对51例甲状腺乳头状癌组织及10例正常甲状腺组织中RASSF1A基因的甲基化状况进行分析。结果表明:甲状腺乳头状癌组织中RASSF1A基因甲基化率为68.6%(35/51),而正常甲状腺组织中未检测到该基因的甲基化,两者之间的差异有统计学意义(P<0.05);RASSF1A基因甲基化与患者年龄、性别无相关性与肿瘤的浸润和转移有相关性,差异有统计学意义(P<0.05)。因此,RASSF1A基因甲基化是甲状腺乳头状癌组织中常见的分子生物学事件,在腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。     

水稻Rho家族OsRac2启动子的转基因功能鉴定

采用PCR扩增的方法,构建了OsRac2基因转录起始位点上游1.7 kb的启动子5′缺失植物表达载体,转化烟草并筛选阳性转基因植株.以多种激素处理转基因烟草,通过组织化学分析和GUS荧光活性的检测,证实Os-Rac2启动子上存在着一些激素应答元件,该基因的表达可能受茉莉酸的正调控,脱落酸等激素的负调控.     

外源hDAF基因对转基因猪影响的初步研究

应用显微注射方法将外源hDNA基因导入湖北白猪的受精卵,获得了相应的转基因猪,4．2,8．0kb两种导入外源基因片断移植后死胎率分别为20．00％,39．71％,差异不显著,8．0kb基因产仔畸形率为11．76％,而4．3kb基因无畸形,结果表明,原核基因对转基因猪有明显的致畸作用,G0代转基因猪60日龄重,6月龄重对照组差异均不显著,表明外源基因的整合位点较理想。     

转基因猪外源hDAF基因的定位

应用非同位素原位杂交技术研究转基因猪外源ｈＤＡＦ基因在受体基因组染色体上的整合及其定位,结果表明,外源基因在转基因狸中呈随机多位点整合,转基因分别定位在２Ｐ、６Ｐ＾１４、７Ｐ＾１１－Ｐ＾１３、７ｑ＾２６、１１ｑ＾１２、１３ｑ＾４４－ｑ＾４８、１４ｑ＾２６。     

基于PWM扫描算法的启动子区域统计分析

为了寻找启动子区域上转录因子结合位点的分布规律,进而研究这种规律与真核基因表达调控机制之间的关系,该文从已有数据出发,运用位置权重矩阵(PWM)扫描算法对启动子区域上4种与肝脏特异表达相关的转录因子结合位点分布情况进行了初步研究,并提出了一种新的序列评分方法。通过该方法提取的统计特征,肝脏特异基因的鉴别准确率可以达93.33%。实验结果表明:肝脏特异基因的启动子区域上结合位点的分布情况与其他基因相比存在显著差异。新的序列评分方法可以更好地反映这种差异性,实现肝脏特异基因的精确鉴别。     

人STK11基因启动子区域的克隆

通过生物信息学分析,预测人STK11基因可能的转录起始位点和重要的调控区域.以此为基础,构建含人STK11基因上游序列缺失片段的pGL3重组载体,瞬时转染L-02和HeLa两种细胞系,通过检测荧光素活性分析缺失片段的启动活性.结果显示各缺失片段在两株细胞中均有启动活性;当3'端固定在-918时,5'端由-1943--1425的移位对启动活性无明显影响,提示这一区间内不存在重要的顺式作用元件;将5'端固定在-1943时,随着3'端向5'的缩短(-918→-1039→-1160),启动活性明显增强(活性pGL3-1943A＞pGL3-1943B＞pGL3-1943C),提示-1160--1039和-1039--918的区间分别存在负性顺式作用元件,同时提示核心启动子的3'端位于-1160的5'末端.在pGL3-1322(-1322--918)亦观察到启动活性,提示核心启动子的5'端应该位于-1322的3'末端.因此,人STK1 1基因的核心启动子位于-1322--1160之间.     

C57小鼠胸腺和睾丸中roPer1基因启动子区CpGs甲基化分析

利用实时定量PCR方法检测胸腺和睾丸组织中roPer1基因表达时相特点,采用亚硫氢酸修饰法对两种组织两个时间点该基因2个启动子区域5个E-boxCpGs甲基化情况进行研究．结果显示：C57BL／6J小鼠胸腺和睾丸组织中mnrl基因表达没有显著波动性,roPer1基因启动子区CpGs呈低甲基化状态（〈10％）．两种组织中E3和E4甲基化频率存在显著差异（P〈0．01）．在睾丸中,不同时间点E3和E4甲基化频率有显著变化（P〈0．01）．说明在睾丸中,roPer1启动子E-box3的甲基化状态能够随时间波动．但在胸腺和睾丸中,甲基化并不是roPer1基因调节的主要方式．     

OSP-1启动子在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性研究

为获得能在猪卵巢颗粒细胞中高效表达的启动子,本文检测了大鼠卵巢特异性启动子OSP-1(Ovarian specific promoter)在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性。参考大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段,将其定向克隆到pc DNA3.1(+)中替代CMV启动子,并在其下游插入Zs GREEN基因片段,构建真核表达载体p OSP-1-Zs GREEN;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染不同细胞,在荧光显微镜下观察Zs GREEN表达情况,Realtime-RT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动Zs GREEN基因表达的活性。结果表明:经克隆测序,得到了465bp OSP-1启动子序列,重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光。Realtime-RT-PCR结果显示:Zs GREEN基因在卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达,在肌细胞中表达量极低;说明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,可为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。     

C57小鼠胸腺和睾丸中mPer1基因启动子区CpGs甲基化分析

利用实时定量PCR方法检测胸腺和睾丸组织中mper1基因表达时相特点,采用亚硫氢酸修饰法对两种组织两个时间点该基因2个启动子区域5个E-box CpGs甲基化情况进行研究.结果显示:C57 BL/6J小鼠胸腺和睾丸组织中mPer1基因表达没有显著波动性,mPer1基因启动子区CpGs呈低甲基化状态(<10%).两种组织中E3和E4甲基化频率存在显著差异(P<0.01).在睾丸中,不同时间点E3和E4甲基化频率有显著变化(P<0.01).说明在睾丸中,mPer1启动子E-box3的甲基化状态能够随时间波动.但在胸腺和睾丸中,甲基化并不是mPer1基因调节的主要方式.