枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术扩增得到来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因片段，并构建重组质粒pUC-T-GDH，然后将基因片段克隆于大肠杆菌表达载体pBV220中．得到表达质粒pBV-GDH．葡萄糖脱氢酶在含有表达质粒的基因工程菌株中得以诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描结果表明，经诱导表达的葡萄糖脱氢酶约占基因工程菌株总蛋白的45％．葡萄糖脱氢酶活力测试表明，基因工程菌株无细胞抽提液中葡萄糖脱氢酶的活力为7.8U／毫克，约为对照组的30倍．实验结果初步说明，广泛应用于工业化生产的葡萄糖脱氢酶可以在基因工程菌株中得以大量表达并维持较高活力．     

青霉素G酰化酶调节基因定点诱变的研究

构建了大肠杆菌中青霉素G酰化酶（PAC）的调节基因（pacR）翻译起始密码定点突变株。对突变后PAC的表达调控特征进行了研究，结果表明：突变株的pac基因表达后能正常加工成24ku、65ku的α亚基和β亚基；突变后，虽然PAC表达仍需要苯乙酸诱导，但是，可诱导性提高，形成低组成型表达，无葡萄糖有分解代谢物阻遏效应，因而pacR对PAC表达水平存在着影响，pacR基因是葡萄糖以及它的分解代谢物在分子水平上影响PAC表达的另一作用因素。采用突变株进行发酵生产中，PAC产量较亲株提高3倍，而且可以采用葡萄糖作为碳源，有利于改善PAC的生产。     

BDNF参与保护葡萄糖饥饿引起的微血管内皮细胞凋亡

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)是否参与葡萄糖缺乏状态下微血管内皮细胞的保护。方法:使用小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3细胞株构建葡萄糖饥饿模型，分别使用BDNF的siRNA及BDNF-TrkB通路阻断剂对经建模的微血管内皮细胞进行处理，使用流式细胞技术检测细胞凋亡，使用Western blot和qRT-PCR分别对BDNF及其他调控基因的表达进行研究。结果:葡萄糖饥饿会导致微血管内皮细胞凋亡，晚期凋亡水平随着缺糖时间增加而升高，且微血管内皮细胞BDNF表达量上调。在葡萄糖饥饿状态下，使用BDNF受体TrkB的抑制剂K252a阻断BDNF-TrkB通路能增加微血管内皮细胞的早期凋亡；抑制BDNF表达使微血管内皮细胞的凋亡升高。结论:BDNF参与保护葡萄糖饥饿引起的微血管内皮细胞凋亡，并参与非葡萄糖饥饿和葡萄糖饥饿状态下糖酵解关键调控基因PFKM表达水平的维持，从而在维持血管内皮细胞的存活及通过糖酵解供能中发挥重要的调控作用。     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．     

亚硫酸氢钠控制输液杂质的分析方法

亚硫酸氢钠控制输液杂质的分析方法成家珍１基本原理亚硫酸氢钠与葡萄糖３－去氧葡萄糖不饱和邻酮醛结合，生成葡萄糖羟基亚硫酸，使亚硫酸使化学反应延迟，从而减少了５—ＨＭＦ的生成，因此增加了葡萄糖输液的稳定性．２仪器与试药１）仪器：紫外分光光度仪（７５１型、...     

一种简单有效的T7RNA聚合酶调控的植物基因表达系统

T7RNA聚合酶在原核系统的基因表达与调控中起重要作用.将T7RNA聚合酶基因的5'端与来自SV40大T抗原基因的核定位信号编码序列融合在一起,利用rolC启动子控制修饰的T7RNA聚合酶基因,与10启动子控制的β-葡萄糖醛酸酶基因串联在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化了烟草叶片.结果表明,这一表达系统能够增加β-葡萄糖醛酸酶基因的瞬时表达.这为提高外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具.     

多聚酶链反应技术在淋病检测上的应用

本文应用多聚酶链反应（ＰｏｌｇｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术对直接涂片镜检淋球菌阴性患者１００例进行淋球菌ｃｐｐＢ基因片段测定。其中ＰＣＲ阳性者高达５４例，占５４％，该组病人中有２０例尖锐湿疣患者，其中ＰＣＲ阳性者１３例，占６５％。以上结果提示：ＰＣＲ技术可明显提高淋病患者的检出率。     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控

采用酵母杂合启动子PADH2－CUP1或PADH2－GAPDH及终止子TADH1，构建了一系列酵母表达载体．在这些表达载体中插入乙肝病毒表面抗原S－preS1融合基因SA－28后，将合乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒PHC11的BamHI位点．然后将表达质粒分别转化酿酒酵母Y16，Y19．对SA－28基因表达的研究表明，在酵母菌胞内实现了SA－28基因的高表达，且表达受葡萄糖浓度调控．     

大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在野生型专性自养嗜酸性氧化硫硫杆菌Tt-Z2中的表达

利用PCR技术扩增E．coli K-12磷酸果糖激酶-1基因(pfkA)，将该基因与广泛寄主的IncQ质粒pJRD215连接构建重组质粒pSDK-1，该质粒可与pfk基因缺陷株E．coli DF1010互补．通过接合转移的方式将其导入专性自养极端嗜酸性氧化硫硫杆菌Tt-Z2中并得到表达．pSDK-1在宿主Tt-Z2中有较好的稳定性，在无选择压力条件下连续传50代仍可保留68％．酶活性测定表明，pSDK-1的pfkA基因在缺陷株E．coli DF1010中表达水平略高于出发菌株E．coli K-12；而在氧化硫硫杆菌中则以较低水平进行表达．葡萄糖可促进含pSDK-1的氧化硫硫杆菌Tt-Z2的生长，而对照菌株的生长则未受明显影响．说明重组菌可部分利用葡萄糖作为碳源而生长．     

基于不同碳源的生物膜特性分析

以多孔陶瓷作为载体,并分别以葡萄糖和苯甲酸作为碳源培养生物膜,在好氧条件下比较不同生物膜去除COD和氨氮的速率.借助于微电极技术对两种生物膜微观结构的研究表明：以葡萄糖为碳源所培养的生物膜对氧的利用率高于苯甲酸.动力学分析结果表明：葡萄糖培养的生物膜其最大氧消耗速率为80 mg O2/（gVSS.h）,远大于苯甲酸培养的生物膜[20 mg O2/（gVSS.h）]的氧消耗速率.分子生物学分析结果表明,以葡萄糖为碳源培养的生物膜内的微生物种类数是苯甲酸培养的生物膜内的1.5倍.     

利用噬菌体T7RNA聚合酶在大肠杆菌（E.coli）中引导人…

我们将人尿激酶原因重组到含Ｔ７基因ψ１０启动子的质粒中，用异丙基硫代半乳糖苷诱导，在大肠杆菌的ＢＬ２１菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ。用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。     

利用噬菌体T＿7RNA聚合酶在大肠杆菌（E．coli）中引导人尿激酶原克隆基因的表达

我们将人尿激酶原基因（ｐｒｏ－ＵＫ）重组到含Ｔ＿７基因１０启动子的质粒（ｐＥＴ３ｃ）中，用异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包含体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ．用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ。这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。     

重组促性腺激素释放激素基因原核表达的影响因素

为得到较多的GST-GnRH/TRS融合蛋白,深入研究其性质,对工程菌内GST-GnRH/TRS基因表达的条件进行了研究。结果表明,诱导GST-GnRH/TRS基因原核表达的最佳IPTG浓度为0.2mmol/L;在30℃诱导培养,能够获得较高的蛋白表达量;最佳诱导培养时间2h;最佳诱导培养的初始pH值为7.0;在振荡转速为135r/m1n、诱导培养时间为2h时,增大接种量,有利于原核基因的表达;在培养基因中添加适量的葡萄糖,能够提高GST-GnRH/TRS基因的原核表达,但葡萄糖含量较高时也不利于GST-GnRH/TRS基因原核表达;K 、Mg2 、Ca2 、Fe3 抑制GST-GnRH/TRS基因的原核表达,其中K 抑制作用最为强烈;添加少量的NH4 有利于提高GST-GnRH/TRS基因原核表达的量,但NH4 含量过高也不利于GST-GnRH/TRS基因原核表达。     

幽门螺杆菌粘附素基因的原核表达

目的：构建幽门螺杆菌粘附素（hpaA）基因的原核表达载体，并诱导表达。方法：用PCR扩增hpaA目的基因片段，克隆至pQE-30表达载体中，构建含目的基因的表达质粒pQE-hpaA，转化E．coli DH5α，经IPTG诱导表达蛋白HpaA；Western blot分析其免疫反应性。结果：经测序hpaA基因片段由783bp组成，可编码260氨基酸残基的多肽。经SDS—PAGE分析相对分子量（Mr）约为30000。可溶性表达占全菌的42％以上。Western blot分析能与Hp全菌抗血清反应。结论：成功构建了粘附素hpaA基因的原核表达载体并能高效表达，为研制Hp疫苗提供理论依据。     

RT-PCR法检测大鼠组织中GLUT8基因表达特异性

采用半定量RT_PCR技术检测青春前期和成年大鼠的主要组织中GLUT8基因mRNA表达水平.实验结果显示,葡萄糖转运蛋白GLUT8基因在成年和青春前期大鼠的睾丸组织中都有高度表达,在心脏和肾脏组织中有少量表达,在肝、脾等组织中的表达是微量的;在成年大鼠睾丸组织中,Leydig细胞、睾丸生精细胞以及附睾的精子细胞中GLUT8基因都有大量的表达,其中以在Leydig细胞中的表达最丰富,而且GLUT8基因在睾丸生精细胞中的表达水平高于附睾的精子细胞.结果说明GLUT8蛋白主要分布在大鼠睾丸组织中,并且主要在Leydig细胞和精子细胞中参与葡萄糖转运和能量代谢与供应.     

大鼠再生肝8种细胞的葡萄糖代谢基因转录谱预示的代谢活动

为了解大鼠肝再生中8种肝脏细胞的葡萄糖代谢基因转录谱及其预示的葡萄糖代谢活动,用percoll密度梯度离心结合免疫磁珠分选方法分离大鼠再生肝的8种细胞,用RatGenome2302.0芯片等检测上述细胞的葡萄糖代谢基因在大鼠肝再生中的表达变化,用H-Cluster软件分析基因表达模式,用生物信息学和系统生物学等方法分析基因表达变化预示的生理活动.结果表明,48个葡萄糖代谢基因在大鼠肝再生中发生了有意义的表达变化,其中上调、下调和上/下调的基因数分别为20、14、14,上述细胞的相应基因数为14、8和0,11、6和0,6、4和0,7、11和0,11、6和2,6、5和1,12、5和0,9、9和1,呈现21种表达相关性.上述葡萄糖代谢基因转录谱预示,肝细胞和库普弗细胞的3-磷酸甘油醛合成增多,肝细胞和胆管上皮细胞的烯醇式丙酮酸合成增多,肝星形细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、陷窝细胞和树突状细胞的通过三羧酸循环产生ATP活动增强.结论:大鼠肝再生与葡萄糖代谢密切相关.     

实时定量PCR研究大鼠肌肉组织基因表达

运用实时定量聚合酶链式反应(RQ-PCR)研究了正常以及患有糖尿病大鼠的肌肉组织中胰岛素信号转导通路中重要的信号传导分子基因表达,结果表明:四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠肌肉组织的胰岛素受体、胰岛素受体底物1和葡萄糖转运体4的mRNA表达下调,胰岛素磷脂酰肌醇3激酶的mRNA表达上调;糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖转运体4的mRNA含量下降可能会引起糖摄取能力的下降.从而导致四氧嘧啶诱导大鼠肌肉组织胰岛素抵抗.     

大口黑鲈Micropterus salmoides仔、稚鱼窒息点与耗氧率的初步测定

在多种水温条件下，对平均体长１０．５ｍｍ和３０．０ｍｍ的大口黑鲈仔、稚鱼进行了窒息点与耗氧率的测定。结果表明：仔、稚鱼的平均窒息点分别为２．１５ｍｇ／ｌ和０．５４ｍｇ／ｌ，而平均耗氧率各为０．７６１６ｍｇ／ｇ·ｈ和０．２２２４ｍｇ／ｇ·ｈ。鱼体规格和水温对窒息点及耗氧率均有较大影响。在水温相同的条件下，仔、稚鱼的耗氧率呈现明显的昼夜变化。     

地塞米松和胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机理

用地塞米松和胰岛素长期作用3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，用胰岛素增敏剂罗格列酮改善胰岛素抵抗，微量化GOD=POD法检测培养基中残存的葡萄糖，并检测细胞中葡萄糖转运子G1ut4基因和蛋白及胰岛素信号传递元件IRS—1的基因变化．探讨了地塞米松和胰岛素诱导3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗的机理．结果发现：①地塞米松和胰岛素诱导3T3—L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，细胞对葡萄糖的摄取减少．罗格列酮改善抵抗后，葡萄糖的摄取较抵抗组增加．②抵抗时，葡萄糖转运子G1ut4基因和蛋白水平明显降低，改善后基因表达上调显著，蛋白水平升高，介于正常对照组与抵抗组之间．②IRS-1在抵抗时下调，用罗格列酮改善后，IRS—1的基因水平无明显变化．     

FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及全基因组表达谱变化研究

为了研究肥胖基因FTO过表达对小鼠胰岛β细胞功能的影响以及基因表达谱的变化,构建小鼠FTO基因过表达慢病毒载体,包装慢病毒颗粒并感染小鼠胰岛MIN6细胞.利用QPCR和WesternBlot技术检测FTO基因在MIN6细胞中过表达情况,并检测葡萄糖刺激检测胰岛素的释放情况,进一步利用小鼠全基因芯片检测FTO过表达对小鼠胰岛MIN6细胞表达谱的影响.结果表明：慢病毒载体成功介导了FTO在MIN6细胞中过表达,FTO过表达可以显著抑制MIN6细胞的胰岛素释放.表达芯片的结果显示FTO改变MIN6细胞表达谱,发现多达922个的差异基因.FTO过表达改变了小鼠胰岛细胞的表达谱,差异基因通过一些重要信号通路影响小鼠胰岛β细胞的生物学功能.