DNA甲基转移酶抑制剂DAC对AcMNPV感染的影响

通过DNA甲基转移酶抑制剂DAC(地西他滨,decitabine)改变DNA甲基化水平,研究杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)DNA的甲基化与病毒复制和基因表达调控的关系。通过流式细胞术和病毒mRNA的Real-time PCR检测发现,低浓度DAC(30nmol/L)处理细胞后会使报告基因绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein gene,gfp)的表达提前,且表达水平明显上升。对低浓度DAC处理组和对照组产生的病毒效价监控表明,低浓度DAC的存在可以提高病毒的效价。经连续DAC处理,在第六代细胞中生产的AcMNPV多角体感染甜菜夜蛾后,幼虫死亡率明显高于对照组。这些结果表明,DAC对杆状病毒DNA复制和基因表达具有一定作用。     

AcMNPV p95基因一段339 bp序列在病毒复制中的作用

杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的p95基因编码的P95蛋白是病毒核衣壳的组成部分,也是虫体经口感染相关因子PIF(Per os Infectivity Factor)复合体的组成部分.前期研究表明,完整的P95蛋白对病毒的复制是非必需的,其中一段450bp的序列可以部分弥补p95基因的作用.本研究将p95基因一段339bp的片段(Core339,AcMNPV基因组位置:69 576~69 914bp)以正反两个方向分别插入到p95基因敲除的AcMNPV基因组中多角体位点的polyA之后,构建了两株重组病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-.该两株病毒能在Sf9细胞中正常复制,复制水平与p95基因正常的AcEGFP相当,但复制速度较慢.重组病毒感染细胞的Western blot分析未检测到P95蛋白的表达.这一结果表明P95蛋白的缺失对病毒在细胞中的复制没有显著影响,但核心片段Core339对于病毒复制具有关键作用.     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

全长和截短的δ内毒素cryIAc基因在昆虫杆状病毒表达？…

在昆虫病毒转移载体ｐＶＬ１３９３多角体基因启动子下游克隆了全长的苏芸金杆菌δ内毒素基因ｃｒｙＩＡｃ，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１，用ＫｐｎＩ将ｃｒｙＩＡｃ基因进行了截短，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ２。随后在两种重组转移载体ｃｒｙ基因的下游引入了ＩＥ１启动子驱动的ｎｅｏ基因作为筛选标记和ＳＶ４０小ｔ抗原终止区作为ｃｒｙ基因的终止信号，得到了重组转移载体ｐＶＬＹ１ｎｅｏ和ｐＶＬＹ２ｎｅｏ，分别用两种重     

Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV的复制

从Tn5转座子介导的AcMNPV随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP-P95in.PCR确认p95基因中插入了Tn5转座子;Western blot也证实AcApra41和AcGFP-P95in感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95 ku变为 55 ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的.     

赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望

赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景.     

载脂蛋白E-基因敲除鼠VLDL和IDL在动脉硬化中的作用

探讨载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）－基因敲除鼠极低密度脂蛋白（ＶＬＤＬ）和中间密度脂蛋白（ＩＤＬ）组分（ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ）致动脉硬化作用．采用超离法从ａｐｏＥ－基因敲除鼠血浆中分离ＶＬＤＬ和ＩＤＬ组分,与鼠腹腔巨噬细胞共育,观察ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ与巨噬细胞的相互作用．ＡｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ导致细胞胆固醇酯含量显著增加．其诱导的细胞［３Ｈ］胆固醇油酸脂量高达１５．１ｎｍｏｌ／ｍｇ细胞蛋白,是天然低密度脂蛋白的８．４倍．形态学观察显示,经ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ处理的巨噬细胞与苏丹黑Ｂ呈阳性染色．细胞结合实验表明,１２５Ｉ－ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ与巨噬细胞的总结合可被非标记配基取代８０％以上,特异结合呈一饱和图形．同时细胞缔合和细胞内降解实验也显示相似结果．非修饰的ａｐｏＥｋｏ－ＶＬＤＬ／ＩＤＬ可通过一特异而不依赖于ａｐｏＥ的途径导致巨噬细胞胆固醇酯的显著蓄积     

重组杆状病毒AcMNPV—BmK IT—vcath的构建及毒力分析

利用Bac-to-Bac载体系统,构建了含有东亚钳蝎Buthusmartensii Karsch昆虫特异性神经毒素基因(BmK IT)和杆状病毒组织蛋白酶基因(vcath)的重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT-vcath,使这两个基因分别位于plO基因启动子(Pp10)和多角体基因启动子(Pph)的控制下高效表达.抗棉铃虫毒力分析表明,该重组病毒的LC50值为28 829.5 pfu/mL,比野生型病毒的LC50值(33114.5 pfu/mL)降低13%;重组病毒的LT50值为3.5d,而野生型的LT50值为4.1d,提高了14.6%,表明该重组病毒的活性比野生型病毒有明显的提高.     

重组杆状病毒的研究 Ⅰ.含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的粉纹夜蛾核型多角体病毒

以昆虫杆状病毒(Baculovirus)为载体、昆虫虫体和昆虫细胞为受体的基因工程,是目前正在开拓的富有前途的新领域之一.杆状病毒载体系统的优点在于:对外源基因的容量大;病毒基因组能提供一个可插入外源基因而对病毒复制本身不受影响的非必需区(多角体基因),同时提供一个极强的启动子,使植入的外源基因能高效表达;能大规模低成本地饲养寄主昆虫,从而有可能大量获得具有重要经济价值的外源基因表达产     

Construction and function of recombinant AcMNPV with double copies of v-cath gene

Two recombinant baculoviruses, dciAcMNPV and dcdAcMNPV in which another copy of the v-cath gene controlled by ie1 promoter and polh promoter was inserted, were respectively constructed by the Bac-to-Bac system. The expression of the v-cath gene of the recombinant baculoviruses in Sf9 cells at different phases was investigated by SDS- PAGE and Western blot. The results showed that only recombinant virus dciAcMNPV containing late gene v-cath driven by early gene promoter could express V-CATH protein, cathepsin encoded by virus genome, 12 h post-infection and dcdAcMNPV containing late gene v-cath driven by late and very late gene promoters could express more V-CATH protein. Negative control ncAcMNPV, a mutant deleted v- cath gene, could not express V-CATH protein at all. The Spodopera exigua larvae were infected with viruses respectively and the results showed that the toxicity was as follows: dcdAcMNPV>dciAcMNPV>wtAcMNPV>ncAcMNPV. The toxicity of recombinant viruses and the characters of dead larvae showed that the v-cath gene was relative to viral toxicity and host liquefaction. Recombinant baculovirus dcdAcMNPV might be used as a new kind of safe viral-pes- ticide, because of its high toxicity obtained by adding another gene copy and changing the expression level of its own gene relative to virulence.     

DNA甲基化对杆状病毒极早期和滞早期启动子转录活性的影响

利用体外DNA甲基化酶和荧光素酶报告系统分析了DNA甲基化对杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的8个极早期和滞早期基因启动子表达活性的影响.研究结果表明,病毒极早期基因ie1和ie0启动子的活性受到甲基化修饰的强烈抑制,pe38启动子活性受到部分抑制;同时滞早期启动子p35、DNApol、lef1、lef3和lef8的启动子则在甲基化处理后得到一定程度的激活.转染的同时用AcMNPV感染细胞,在多数启动子中并没有改变甲基化处理对它们表达活性的影响,但使其影响程度有所减弱.在另一些启动子(pe38,p35,lef1)中,AcMNPV的感染使甲基化的作用基本消失.这些结果表明DNA甲基化对一些杆状病毒启动子的转录活性有一定的调控作用.     

鸡染色质绝缘子HS4的不同区域对杆状病毒表达egfp基因的影响

染色质绝缘子是一种具有保护目的基因免受周围基因调控影响,保证基因稳定表达的DNA元件.前期的研究表明,当鸡染色质绝缘子HS4被置于目的基因表达框下游时,可以显著提高杆状病毒介导的基因的表达水平.为了进一步认识HS4作用的机制,构建了携带HS4绝缘子不同区域的6种重组病毒,比较了它们对报告基因egfp表达的影响.结果发现,相比对照病毒,插入HS4全长片段的重组病毒vBG-HS4-1200,以及同时插入250bp核心区域和400bp连接片段的重组病毒vBG-HS4-650在感染Sf9细胞后报告基因egfp的表达水平明显提高.这个结果与前人在哺乳细胞表达系统中所得出的结果基本相符,从而进一步证实HS4在裂解型病毒中同样可以通过表观遗传学修饰调控基因的表达.     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

Construction and function of recombinant AcMNPV with double copies of v-cath gene

Two recombinant baculoviruses, dciAcMNPV and dcdAcMNPV in which another copy of the v-cath gene controlled by ie1 promoter and polh promoter was inserted, were respectively constructed by the Bac-to-Bac system. The expression of the v-cath gene of the recombinant baculoviruses in Sf9 cells at different phases was investigated by SDSPAGE and Western blot. The results showed that only recombinant virus dciAcMNPV containing late gene v-cath driven by early gene promoter could express V-CATH protein, cathepsin encoded by virus genome, 12 h post-infection and dcdAcMNPV containing late gene v-cath driven by late and very late gene promoters could express more V-CATH protein. Negative control ncAcMNPV, a mutant deleted vcath gene, could not express V-CATH protein at all. The Spodopera exigua larvae were infected with viruses respectively and the results showed that the toxicity was as follows: dcdAcMNPV>dciAcMNPV>wtAcMNPV>ncAcMNPV. The toxicity of recombinant viruses and the characters of dead larvae showed that the v -cath gene was relative to viral toxicity and host liquefaction. Recombinant baculovirus dcdAcMNPV might be used as a new kind of safe viral-pesticide, because of its high toxicity obtained by adding another gene copy and changing the expression level of its own gene relative to virulence.     

AcMNPV大立方形多角体突变株突变位点的证实

纯化了３株在共转染后形成正常多角体的病毒株,提取其病毒ＤＮＡ,并对其做了ＥｃｏＲⅠ、ＢｇｌⅡ酶切分析;克隆含多角体蛋白基因的ＥｃｏＲⅠＩ片段并进行序列测定,证实了此病毒株为回复突变株．     

人甲胎蛋白增强子和鸡HS-4绝缘子对杆状病毒基因表达的影响

构建了2株重组杆状病毒AcGFP-E和AcGFP-E-I.两者均带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)的表达框和人甲胎蛋白增强子,同时后者还在报告基因表达框两侧带有鸡HS-4绝缘子.在昆虫细胞Sf9中,两种重组病毒都能正常复制.与仅带有报告基因的对照重组病毒AcGFP比较,AcGFP-E表达GFP的水平明显提高,但AcGFP-E-I表达水平却明显降低.这项研究首次分析了异源增强子和绝缘子对杆状病毒基因表达的影响,但其中的机制还有待深入研究.     

PRV闽A株gE基因抗原编码区片段在昆虫细胞中的表达研究

伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E是一种在伪狂犬病的根除计划中具有重要作用的糖蛋白.将伪狂犬病病毒闽A株gE基因抗原编码区片段克隆到杆状病毒Bac-to-Bac系统表达载体pFastBacHTa中,获得的重组表达载体pFastBacHTa-FS转化大肠杆菌DH10BAc感受态细胞后,得到的重组Bacmid DNA在脂质体介导下转染粉蚊夜蛾Hi5细胞,通过细胞内同源重组,获得了含目的片段的重组病毒.此重组病毒感染Hi5细胞后72 h,细胞总蛋白的SDS-PAGE与Western-Blot结果表明,gE基因抗原编码区片段在Hi5细胞中得到了正确表达,表达产物约35000,占细胞总蛋白的9.31%.溶解性分析显示该片段在Hi5细胞中为不可溶性表达.