毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究

研究了毕赤酵母基因工程菌高密度培养条件。在全合成培养基的基础上考察了诱导过程中添加(NH₄)₂SO₄、微量元素PTM₁、油酸、甲醇加量及pH等因素对重组人血清白蛋白表达的影响，发现PTM₁能显著提高白蛋白的表达，6mL/L时蛋白表达量最大。诱导期硫酸铵浓度维持在 3g/L左右蛋白表达量最大，高于3g/L抑制蛋白表达。酸性环境不利于蛋白表达，诱导过程维持pH6.0～6.5最佳。甲醇最佳诱导浓度为10mL/L。添加0.05%的油酸可有效提高蛋白表达。可以此作为发酵罐上发酵培养流加成分的参考。     

pMAL-p2X系统表达SLA-Ⅰ复合体蛋白

SLA-Ⅰ/pMAL-p2X为人工构建的原核表达体系.为获取最佳表达的SLA-Ⅰ复合体蛋白及其可溶性表达含量,设计实验对其进行表达优化(pH值、温度、菌体密度、IPTG浓度、诱导时间),SDS-PAGE检查目的蛋白的表达.另外检查目的蛋白的可溶性表达含量.结果显示,SLA-Ⅰ在pMAL-p2X的最佳表达条件为pH=8.0、T(温度)=37 ℃、OD600=1.0、IPTG=0.4 mmol/L和t(诱导时间)=5 h;证明目的蛋白可溶性表达含量占总表达蛋白的70%左右.研究表明pMAL-p2X系统适合于生产可溶性的SLA-Ⅰ复合体蛋白,便于今后进一步研究SLA-Ⅰ类分子结构和功能.     

番茄抗白粉病必需基因ShGSTU1原核表达条件优化

采用RT-PCR技术从番茄中扩增谷光甘肽转移酶基因ShGSTU1,构建该基因的原核表达载体pET28aShGSTU1和pET32a-ShGSTU1,并对重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达条件进行优化,主要对诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度进行分析.结果表明:重组蛋白在表达载体pET28a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,37℃诱导4h;在表达载体pET32a中的最佳表达条件为1mmol/L IPTG,30℃诱导5h.     

新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a( ),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210 μg/L.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

集胞藻PCC6803基因sll0853的克隆、优化表达及其结构功能预测

从集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803提取总DNA,利用PCR扩增目的基因sll0853,构建重组T-0853克隆载体和pET-0853原核表达载体.为了提高sll0853在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明sll0853基因蛋白表达的最佳条件.结果表明:目的蛋白在28℃、0.2mmol/L IPTG、诱导6h表达量分别达高峰.通过生物信息学软件预测基因sll0853可能具有裂合酶的功能.     

西瓜花叶病毒HC-Pro基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物HC-Pro基因,大小为1 371 bp.将HC-Pro基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与其它国家HC-Pro核苷酸同源性为90.7%~94.8%.将HC-Pro基因定向插入EcoR I/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WHC,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为57 kD的HC-Pro蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 2 h后蛋白开始表达,继续诱导到8h后表达量变化不大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了HC-Pro蛋白的抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与HC-Pro发生血清学反应.     

培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

致病性鸡大肠杆菌pilA和外膜蛋白C原核诱导表达条件的优化

分别从温度、接菌量、诱导时机、IPTG浓度、诱导时间等条件对2种重组菌株BL21/pET - 28a - pilA和BL21/pET - 28a - ompC进行优化.得到最佳诱导条件:BL21/pET - 28a - pilA菌株为40℃摇培,80μL的接菌量,160r/min摇培2h后加入终浓度为0.96mmol/L的IPTG,再诱导表达4h,得到最高特异蛋白表达量;BL21/pET - 28a - ompC菌株为37℃培养,80μL的接菌量,160r/min摇培2.5h后加入终浓度为0.64mmol/L的IPTG,再诱导表达6h,得到最高特异蛋白表达量.     

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

在克隆、表达纳豆激酶基因的基础上,对IPTG浓度以及诱导时间两个重要影响因子进行优化选择.结果表明,在IPTG 100μg/mL诱导2.5h时,纳豆激酶的表达量相对较高,约占菌体蛋白重量的46.63%,为实验最佳的诱导条件.     

HBV/HEV二价疫苗性抗原基因在E.coli中表达条件优化的初步研究

为有效提高由乙型肝炎的S抗原基因和戊型肝炎ORF2编码区羧基末端414-606氨基酸基因片段构建的高效表达载体质粒PTΩ-T7SE在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达效率,研究了质粒稳定性、葡萄糖质量分数、pH值、IPTG浓度、转接量、诱导时间、诱导温度、溶解氧对目的蛋白相对产量的影响,优化得到了较好的培养方法,使目的蛋白的相对含量达48.23%,菌体干重达0.596 3 g/L.结果表明,采用优化方法可制备较高纯度蛋白.本研究为大规模的发酵工艺提供了依据.     

基因重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子的发酵条件优化

采用三角摇瓶来优化基因工程菌表达重组鲨鱼软骨血管生成抑制因子(SCAIF)的最佳发酵条件,并以此为基础在Biotop CF-10L自动控制发酵罐进行发酵培养.基因工程菌BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)诱导表达SCAIF蛋白的最佳摇瓶培养条件是:接种量为2%、装液量为75 mL/500 mL、加入IPTG的诱导时间为培养2 h后、IPTG浓度为0.25 mmol/L、诱导时间为2 h.BL21(DE3)/pET3c(SCAIF)菌种在Biotop CF-10L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到10 L发酵培养基中,设定pH 7.0,温度37℃,培养4 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,诱导2 h后终止发酵.发酵罐中获得的菌体量为10.2 g/L,蛋白表达率为25%左右.     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

重组工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA可溶性AiiA蛋白的发酵条件优化

通过对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA的摇瓶发酵培养条件进行优化,确定了AiiA蛋白可溶性表达的最佳发酵培养基为牛肉膏蛋白胨.目的蛋白可溶性表达的最佳诱导条件为:IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导初始OD600为0.5,诱导时间为20 h,温度20℃,pH为7.0,微量元素Na2HPO420 mmol/L,250 mL三角瓶的装液量为70 mL.优化前可溶性AiiA蛋白的相对含量为2.23 mg/mL,占总目的蛋白的31.4%,优化后达到4.54 mg/mL,占总目的蛋白的60.3%,大大提高了目的蛋白的可溶性表达.     

家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a( )扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a( )中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为5 h.温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22 000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.     

海带热休克蛋白70基因体外原核表达研究

在前期研究克隆得到全长海带HSP70基因的基础上,为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。     

乳糖诱导mIL-9蛋白高效表达研究

研究了乳糖诱导重组工程菌pET(32a+)-rmIL-9/BL21(DE3)高效表达rmIL-9融合蛋白的实验条件,探讨规模化生产rmIL-9的可行性.分别考察乳糖诱导时机、诱导浓度、诱导时间等参数对rmIL-9融合蛋白表达的影响,并通过正交实验,筛选最佳的乳糖诱导条件.结果显示,对于rmIL-9融合蛋白,乳糖作为诱导剂可达到良好的诱导效果,诱导产物的表达量可优于IPTG诱导产物.最优诱导表达条件为:当菌液OD600值为1时,添加终浓度为5g/L的乳糖,诱导9 h可以高效表达目的蛋白.实验表明,采用乳糖可以诱导rmIL-9融合蛋白基因的高效表达,此为动物实验评价rmIL-9治疗黑色素瘤提供了前期基础.     

中介蝮Asn49-PLA2基因原核表达载体的构建及初步表达

以来自中介蝮(G.intermedius)毒腺cDNA文库的3个新Asn49-PLA2基因(GI4-PLA2,GIs-PLA2及其突变体G15'-PLA2)为模板,用PCR及DNA重组技术,将三个PLA2基因克隆到原核表达载体pQE-30,并在宿主茵E.coli Rosseta(DE3)中进行诱导表达.Bam H Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切及测序结果提示,成功构建了3个原核表达栽体(pQE-30/GI4-PLA2,pQE-30/GI5-PLA2,pQE-30/GI2'-PLA2).SDS-PAGE结果表明,中介蝮的3个Asn49-PLA2基因在大肠杆茵中实现表达,而且在37℃、1mM IPTG的诱导条件下,GI4-PLA2和GI5-PLA2的最佳表达时间为25h,而GI5'-PLA2在15h有较高水平的表达.     

中国明对虾ALFFc基因的原核表达与抗血清制备

利用聚合酶链式反应(PCR)技术和基因重组技术克隆了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗脂多糖因子(ALFFc)基因的成熟肽编码序列并构建了pET-DsbA-ALFFc原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)后,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)筛选法获得了1株高表达量重组菌,并通过实验确定其最佳诱导条件为:菌液初始OD6000.7,IPTG终浓度0.8 mmol/L,培养温度37℃,诱导时间3 h.重组蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔制备了抗血清,为进一步研究ALFFc的功能奠定了基础.     

利用大肠杆菌工程菌生产2,3-二磷酸甘油酸的研究

通过基因工程的方法,将表达人源BPGM(bisphosphoglycerate mutase二磷酸甘油酸变位酶,E.C.2.7.5.4.)的质粒转化入大肠杆菌内,并进行培养条件的优化摸索,通过向培养基内加入葡萄糖使大肠杆菌大量发酵生产2,3-BPG(2,3-bisphosphoglycerate,2,3-二磷酸甘油酸).结果表明,当培养基中葡萄糖质量浓度为10 g/L,诱导时间为4 h,大肠杆菌工程菌表达的2,3-BPG含量最高.如果诱导后加入终质量分数为0.5%的Tween 80可以有效促进2,3-BPG分泌到培养基中.诱导后4 h添加新培养基,补加葡萄糖可以使2,3-BPG的产量提高1倍,达到7.5 mmol/L.