尖吻蝮蛇毒出血毒素I0.27nm分辨率晶体结构测定

蛇毒含锌金属蛋白酶与基底膜金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)有着相似的活性区域和生物学功能,它们同属MMP超家族(MMP superfamily)。MMP超家族蛋白能水解基底膜上的胶原蛋白,对结缔组织细胞分化、基底膜形成和降解起着重要的平衡作用。在人体中,这种子衡的失调常导致关节炎和肿瘤疾病。因此,MMP蛋白成为抗癌症和关节炎药物设计研究中的重要靶蛋白。1994年,两种蛇毒含锌金属蛋白酶:来自东部响尾蛇(eastern diamondback rattlesnake)的Adamalysin Ⅱ和来自西部响尾蛇(western diamondback rattlesnake)的Atrolysin C的晶体结构得到解析。但详细的作用机理,特别是出血作用机理目前尚不清楚。     

中国皖南尖吻蝮蛇毒出血毒素Ⅲ初步晶体学研究

1 引言 出血毒素是广泛存在于很多蛇毒中的一种蛋白质,它能引起动物的局部组织出血和坏死,严重的可导致死亡。迄今发现的几乎所有出血毒素均为含锌金属蛋白酶,其氨基酸序列具有较高保守性。目前发现的许多蛇毒出血毒素能水解结缔组织基底膜上的蛋白,因此它们可作为关节炎和肿瘤治疗的靶蛋白。根据其分子量,出血毒素可分为3种类型:低分子量(20～30ku)、中分子量(30～60ku)和高分子量(60～90ku)。最近,两种蛇毒金属蛋白酶:来源于东部响尾蛇无出血活性的AdamalysinⅡ和来源于西部响尾蛇的出血毒素Atrolysin C的晶体结构已得到解析。虽然它们在出血活性表现上有较大差异,但它们的空间结构非常相似。目前的研究结果尚未对出血作用的机理作出空间结构上的解释。     

几个重组蛇毒金属蛋白酶的表达、重折叠及其生物学活性

皖南尖吻蝮蛇毒出血金属蛋白酶acutolysin A除了具有引起动物皮下出血的活性外, 还具有降解纤维蛋白原和纤黏连蛋白的活性. 将acutolysin A以及非出血金属蛋白酶BR的cDNA分别克隆到原核表达载体pET-22b中, 并在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了这两个重组蛇毒金属蛋白酶, 即A-22b和BR-22b. 经变性和复性处理后, A-22b具有明显的出血活性, 但没有对纤维蛋白原和纤黏连蛋白的水解活性; 而BR-22b没有出血活性, 却具有降解纤维蛋白原的活性. 此外, 通过PCR方法构建了两个嵌合体基因C1和C2. C1是由BR基因的5′端330 bp和acutolysin A的3′端285 bp构成的嵌合体基因; C2是由acutolysin A基因的5′端324 bp和BR的3′端336 bp构成的嵌合体基因. 将它们克隆进表达载体pET-22b中得到两个表达质粒, 即pC1-22b和pC2-22b. 并以包涵体的形式表达了相应的两个重组蛋白, 即C1-22b和C2-22b. 经同样的变性和复性处理后, C1-22b与BR-22b类似, 具有较强的纤维蛋白原水解活性, 但没有出血活性. 与A-22b相似, C2-22b具有出血活性但没有对这些蛋白的水解活性. 这些结果暗示, 蛇毒金属蛋白酶的N端主亚结构域在出血活性上很可能起关键作用并极大地影响酶对底物的选择性.     

蛇毒丝氨酸蛋白酶

蛇毒丝氨酸蛋白酶属于糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。蛇毒丝氨酸蛋白酶几乎可作用于哺乳动物凝血,纤溶系统的各个步骤而对凝血,纤溶,血小板功能,血管完整性以及出血等发生影响,蛇毒丝氨酸蛋白酶具有高度的序列相似性（６０％－７５％）,但底物性却具较大的分化;另一方面,它们对生理性丝氨酸蛋白酶剂有较强的耐受性及较长的体内半衰期,这些特性使之成为蛋白酶与功能研究的优良模型,同时也具广阔的药物开发前景和作用药理研究的工     

BmK AS,一种新型骨骼肌Ryanodine受体激动肽的氨基酸序列

前文曾报道从东亚钳蝎毒中纯化了一个新型骨骼肌Ryanodine受体激动肽(BmK AS).本工作将进一步报道该活性肽的完整氨基酸序列.由它的序列(共66个残基)计算出的最小分子量为7698u与经电喷雾质子光谱测定的7696.26u值基本吻合.其分子结构与同一蝎毒中已知的各类Na~ 通道配体间的同源性较差.但与一种独特的非洲蝎所产抗昆虫毒素(AaH IT),同属Na~ 通道配体间却存在着>80%的相似性.1 材料与方法BamK AS的纯化参照文献进行.分别用SDS-PAGE电泳法和电喷雾质子光谱仪鉴定纯化样品的纯度和分子量.     

基质金属蛋白酶-28在人细胞滋养层细胞与绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞中的表达

细胞滋养层细胞和肿瘤细胞的侵入行为具有惊人的相似性，其中基质金属蛋白酶（MMPs）是滋养层细胞和肿瘤细胞侵入的非常重要的介导因素。近来，MMPs家族的一个新成员－MMP－28被克隆并确定下来，采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）、酶谱分析和Northern blot等方法，检测了妊娠早期细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系JEG－3细胞中MMP－28的基因表达和蛋白分泌情况。RT－PCR显示，细胞滋养层细胞JEG－3细胞均有MMP－28mRNA的表达；Northern blot研究显示，JEG－3细胞中MMP-28mRNA的表达强于细胞滋养层细胞中MMP－28mRNA的表达，具有时间依赖关系；酶谱分析显示，JEG－3细胞中MMP－228蛋白分泌 活性高于细胞滋养层细胞中MMP－28蛋白分泌活性，呈时间依赖关系，这与MMP－28的基因表达结果相一致。进一步证明了MMP－28可能在正常妊娠和肿瘤发展等一些与组织重建有关的过程中发挥一定的作用。     

东亚钳蝎毒中一个软瘫型抗昆虫神经毒素(BmK IT2)的初级结构研究

蝎抗昆虫神经毒素根据分子大小可分为长链(含约61或70个氨基酸残基)和短链(含约35个氨基酸残基)两大类,而前者又可根据作用效应的不同分为挛缩或软瘫两种类型.前文我们曾陆续报道了东亚钳蝎(Buthus martemsi Karsch)毒中一个挛缩型抗昆虫毒素(BmK IT)的分离及其初级结构以及一个alpha型(BmK αIT)和4个软瘫型抗昆虫毒素(BmKIT2至IT5)的纯化与鉴定.本文将进一步报道有关其中一个属软瘫型毒素(BmK IT2)氨基酸序列的测定分析结果.     

细胞色素P-450模拟体系的活性中间体——第三类型氧合铬(Ⅴ)——四苯基卟啉配合物的分离、表征和氧化反应

氧合过渡金属卟啉配合物是细胞色素P-450模拟体系的可能活性中间体。已分离和表征的钛(Ⅳ)、钒(Ⅳ)、钼(Ⅳ,Ⅴ)和铬(Ⅳ)等氧合过渡金属卟啉配合物,因其不是有效的氧化剂,所以不是细胞色素P-450模拟体系的可能活性中间体。氧合锰(Ⅳ)卟啉虽能氧化碳氢化合物,但至今还未能分离出。我们曾分离出并表征的氧合铬(Ⅳ)卟啉以及     

纤粘连蛋白-整合素相互作用启动胚泡中基质金属蛋白酶活性

纤粘连蛋白是一种主要的细胞上基质,能够与整合素相互作用,介导胚泡的粘附和扩展,首次发现与纤粘连蛋白共同培养的小鼠胚泡产生基质金属蛋白－２和－９;若无纤粘连蛋白,小鼠胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转号分子,其胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转导通路中的关键信号分子,其反义寡聚脱氧核酸显著抑制纤粘连蛋白诱导的胚泡基质金属蛋白酶活性。结果表明,纤     

青霉素-金属络合物的合成、结构及其抗耐药金葡菌的活性研究

金属离子可以影响许多药物分子的稳定性、体内分布和代谢途径,以至影响到药物的活性。青霉素是一类重要而有发展前途的β-内酰胺类药物,具有高效低毒的优点。一些金属离子如Zn(Ⅱ)和Cn(Ⅱ)能显著催化青霉素分子的水解,这不仅涉及到药物的稳定性,而且涉及到青霉素的作用机理。研究青毒素与金属离子的配位、结构及抗菌活性不仅可以探索     

马氏钳蝎哺乳动物神经毒素Ⅰ的部分氨基酸顺序

前文曾报道,从国产马氏钳蝎毒中首次分离并纯化了被命名为钳蝎毒素Ⅰ和钳蝎毒素Ⅱ的两种哺乳动物神经毒蛋白,其中钳蝎毒素Ⅰ的毒性较钳蝎毒素Ⅱ的约强5倍,于是首先对钳蝎毒素Ⅰ进行了进一步的分析。已测知它是由67个氨基酸残基组成,内含8个半胱氨酸,由氨基酸组成推算的最小分子量应为7567,另一方面,在螯虾巨大纤维的电压钳位实验的初步结果表明,钳蝎毒素Ⅰ的作用是选择地抑制兴奋膜钠通道的失活化(待发表资料),这样看来,钳蝎毒素Ⅰ可能成为研究离子通道的有用工具物。在本工作中又对它的一级结构进     

QSAR模型应用域的表征方法

定量构效关系(QSAR)模型是填补化学品环境安全数据空缺的重要工具.QSAR模型需要明确定义的应用域,才能合理地用于化学品管理.本文回顾了应用域的3种概念:描述符域、结构域和机理域.基于案例,重点介绍了基于分子指纹与相似性度量指标而计算结构域的方法、结构域的特点和优势.讨论了结构.活性地貌(structurc-acti...     

猪肾氨基酰化酶Ⅰ的初步晶体学研究

氨基酰化酶Ⅰ(aminoacylase I,ACY-1)(3.5.1.14)主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中,是生物体进行氨基酸代谢时一个重要的水解酶,它可逆地催化酰化L-氨基酸的水解反应.该酶由772个氨基酸组成,分子量为85.500ku,是一个寡聚酶,由两个相同亚基组成,每个亚基含有一个锌离子.猪肾ACY-1与人的ACY-1的核酸序列有88.3%的同源性,氨基酸序列的同源性为87.7%.将猪肾ACY-1的氨基酸序列放在PROSITE数据库中检索,除了几个潜在的蛋白激酶磷酸化的位点和2个可能的N-糖基化位点外,没有其他明显的特征.把猪肾ACY-1的核酸序列和氨基酸序列与EMBL/GenBank和SwissProt Database中的序列进行比较,除了由E.coli表达的酰氨酶(amidase,succinyl-diaminopimelate desuccinylase),没有发现它与其他蛋白质有同源性,Wilbur-Lipman Algorithm统计分析表明,酰氨酶与猪肾ACY-1序列在400个氨基酸长度内有24%的等同性、这些结果提示,ACY-1是一类新的含锌金属蛋白.张艳等人用CD和FTIR谱对它的二级结构进行了研究.     

尿胰蛋白酶抑制剂的空间结构预测

尿中的胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsin inhibitor,简称UTI)是丝氨酸蛋白酶抑制剂的一种,存在于人类的尿液中,可抑制胰蛋白酶、弹性蛋白酶等多种蛋白酶的活性,是治疗急性胰腺炎的特效药。迄今为止,UTI的三维结构仍属未知。它是一种糖蛋白,含糖量高达50％,同时,它也是一种双结构域蛋白,它的结构信息对于我们研究蛋白质结构域间的相互作用也极有益。鉴于UTI重要的生物学功能以及特殊的结构意义,我们对UTI的空间结构进行了预测,所用的方法是已被众多结构生物学家认可的同源结构预测法,它的基本思想是:蛋白质的空间结构比一级序列更为保守。     

突变酶可抑制爱滋病病毒的生长

目前,人们逐渐认识到酶的作用对人类免疫缺陷综合征病毒(HIV)的复制起着决定性作用。英国WellCOme实验室的研究人员已设法通过替换逆转录酶分子片段上的某些氨基酸的方法,来改变这种酶的活性。逆转录酶在病毒RNA转录成双股DNA过程中起着非常重要的作用,双股DNA可整合于宿主细胞的基因组中。他们认为,如果一些相关酶分子(如逆转录酶)共有一段相似的氨基酸排列,那末,此序列很可能在酶分子的作用中起重要作用。为此,     

眼镜王蛇毒中L-氨基酸氧化酶的分离和纯化

L-氨基酸氧化酶(EC.1.4.3.2)广泛存在于各种蛇毒中,不同蛇毒其L-氨基酸氧化酶的活力、含量以及同工酶谱的差异很大,在以亮氨酸为底物时,蛇毒来源的L-氨基酸氧化酶活力是哺乳动物的400倍,此酶被广泛用于鉴别氨基酸的光学异构体以及从L-氨基酸制备2-酮酸和从3,5-双碘酪氨酸制备甲状腺素,为此蛇毒中L-氨基酸氧化酶的研究无论在理论上还是在实际上都具有一定意义。至今,蝮科和蝰科来源的六种蛇毒中L-氨基酸氧化酶已被纯     

用双杂交系统发现与CPP32相互作用的新型分子的初步研究

作为ICE蛋白酶家族的一员 ,CPP32 (又称Yama ,Apopain)在许多形式的凋亡途径中起极其重要的作用 .为研究调控CPP32的分子 ,本文运用酵母双杂交系统杂找与CPP32相互作用的分子 .首先将CPP32基因克隆到 pGBT9质粒载体中 ,得到的重组质粒命名为pGBT9/CPP .然后将 pGBT9/CPP转化酵母菌HF7C ,再导入人白血病文库质粒 ,用营养缺陷培养基 (TrpLeuHis)初步筛选文库中插入cDNA所编码的序列与CPP32相互作用的菌落 ,再进一步检测 β 半乳糖苷酶活性 .我们共得到 4 2个在营养缺陷培养基上生长的菌落。β_半乳糖苷酸活性检测表明 ,只有 5个菌落在显色底物X_gal的存在下变蓝色 .提取该 5个阳性酵母菌落的质粒 ,电击转化E .coliHB10 1.提取文库质粒 ,经酶切鉴定、重新转化及序列测定后发现 ,与CPP32相互作用的分子为一新型 15肽 ,推测它可能是与CPP32相互作用的结构域     

钙通道Cav3.1的S4区域在其电压依赖性失活过程中的作用

电压依赖性失活在钙通道的生理功能中起重要作用, 参与通道失活的分子结构域目前还不清楚. 为研究T型钙通道Cav3.1分子中第4跨膜区(S4)在电压依赖性失活中的作用, 用Cav1.2通道(无电压依赖性失活)的S4区替换Cav3.1 (快速电压依赖性失活)的相应S4区域, 构建嵌合通道(chimera), 并在卵母细胞中表达, 用双电极电压钳记录其通道电流. 结果显示, 替换结构域Ⅰ中的S4使Cav3.1的稳态失活曲线左移, V_0.5失活和k_失活值显著改变; 替换其余结构域(Ⅱ~Ⅳ)的S4对失活的电压依赖性无显著影响. 结果表明, 结构域Ⅰ的S4参与通道的失活过程, 不同结构域的S4 在Cav3.1失活中的作用不同, 提示结构域Ⅰ的S4可能起偶联膜电位变化与通道失活的作用, 膜电位变化引起S4移动可能是通道失活区分子结构变化的触发因素.     

猪肾氨基酰化酶Ⅰ的初步晶体学研究

<正>氨基酰化酶Ⅰ(aminoacylase I,ACY-1)(3.5.1.14)主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中,是生物体进行氨基酸代谢时一个重要的水解酶,它可逆地催化酰化L-氨基酸的水解反应.该酶由772个氨基酸组成,分子量为85.500ku,是一个寡聚酶,由两个相同亚基组成,每个亚基含有一个锌离子.猪肾ACY-1与人的ACY-1的核酸序列有88.3%的同源性,氨基酸序列的同源性为87.7%.将猪肾ACY-1的氨基酸序列放在PROSITE数据库中检索,除了几个潜在的蛋白激酶磷酸化的位点和2个可能的N-糖基化位点外,没有其他明显的特征.把猪肾ACY-1的核酸序列和氨基酸序列与EMBL/GenBank和SwissProt Database中的序列进行比较,除了由E.coli表达的酰氨酶(amidase,succinyl-diaminopimelate desuccinylase),没有发现它与其他蛋白质有同源性,Wilbur-Lipman Algorithm统计分析表明,酰氨酶与猪肾ACY-1序列在400个氨基酸长度内有24%的等同性、这些结果提示,ACY-1是一类新的含锌金属蛋白.张艳等人用CD和FTIR谱对它的二级结构进行了研究.     

基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展中的表达差异分析

研究了基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展过程中的表达变化。用RT－PCR检测配对食管癌手术标本及食管癌早期活检组织中MMP20基因表达,用免疫组织化学染色和Western印迹检测表达的MMP20蛋白。发现MMP20基因在mRNA和蛋白质水平上均为食管部过表达,MMP20基因的表达在食管癌发生早期未见明显升高,在浸润癌期明显过高表达,提示在食管癌发展中MMP20过表达与癌细胞浸润相关,是食管癌演进过程中的晚期事件。