高致病性禽流感病毒广谱嵌合抗体的构建表达及活性研究

高致病性禽流感病毒高度变异且缺乏有效的治疗药物.在前期研究工作中,本课题组发现一株鼠源广谱中和单抗13D4,在动物实验中显示出对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果.在本研究中,从分泌13D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出轻重链可变区DNA序列,并分别与人IgG1的轻重链恒定区基因序列拼接,构建人-鼠嵌合抗体.筛选出稳定表达嵌合抗体的CHO细胞株,从培养上清中纯化出嵌合抗体.竞争Elisa结果表明,嵌合抗体与鼠源单抗能够识别同一个抗原表位并具有相似的亲和力.血凝抑制反应和中和活性测定结果证明,13D4嵌合抗体保留了对不同亚型H5N1病毒的广谱反应性,并且对两株H5N1病毒具有中和活性.本研究获得的13D4嵌合抗体将具有潜在的治疗价值.     

聚合酶链反应法扩增免疫球蛋白变区基因

用异硫氰酸胍抽提抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株2F7的总RNA,用逆转录酶合成第一链cDNA,用PCR技术扩增出351 bp的重链变区基因(V_H)和324bp轻链变区基因(V_L),分别克隆至pUCV_(NP)-PCR和pWR13载体上,经筛选和DNA序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的变区基因.     

抗HBsAg单链Fab抗体基因酵母表达载体的构建

采用重叠PCR技术 ,以抗乙肝表面抗原 (HBsAg)IgG铰链区基因为Linker将Fab抗体基因的重链和轻链连接起来 ,构成单链Fab基因。通过测序鉴定 ,克隆的单链Fab基因与理论上的完全一致 ,并成功构建含完整单链Fab基因的毕赤酵母 (P pastoris)表达载体。     

抗人前列腺素D合成酶嵌合抗体基因的构建

采用RT-PCR技术,从1株稳定分泌抗人L-PGDS单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞中扩增抗体的可变区基因,得2个Vk和1个VH．序列经Igblast比对分析,其中1个VK为鼠骨髓瘤细胞系内固有的无功能基因;另-Vk和VH具备鼠抗体可变区特征,为抗体功能基因．经双酶切,将抗体可变区功能基因分别与表达载体pAG4622、pAH4604中的人IgG相应恒定区相连,构建成抗人L-PGDS的人-鼠嵌合抗体基因。     

抗CD71人-鼠嵌合抗体的制备及其诱导肿瘤细胞凋亡

目的 :研究在液氮中冻存 2年的转染瘤细胞株 (D2C)复苏后其分泌抗CD71人 -鼠嵌合抗体的特异性、分泌量及诱导肿瘤细胞凋亡的效应。方法 :用ELISA方法检测转染瘤细胞培养上清的抗体分泌量。经DEAE SephadexA 5 0离子交换法纯化产生的抗体 ,并采用SDS PAGE电泳鉴定 ;台盼蓝拒染法观察其对K5 6 2细胞生存的影响 ;细胞计数和MTT试验测定嵌合抗体及鼠源性抗体对K5 6 2细胞的作用 ;琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察K5 6 2细胞凋亡。结果 :Balb/c裸鼠腹腔接种转染瘤细胞后 ,每只裸鼠腹水量在 3～ 5mL。抗体经纯化 ,产量约为 1～ 2mg/mL腹水。经SDS PAGE电泳鉴定 ,在分子量 5 5kD和 2 7kD处 ,可见有抗体IgG重链和轻链的染色条带。抗CD71嵌合抗体及鼠源性抗CD71抗体均可抑制K5 6 2细胞的增殖作用 ,且二者抑制作用无显著性差异 (P >0 .0 5 )。经琼脂糖凝胶电泳和透射电镜观察分别可见抗体诱导的K5 6 2细胞DNA梯形条带和细胞凋亡的形态改变。结论 :液氮中冻存 2年的转染瘤细胞体外生长良好 ,抗体分泌稳定 ,特异性高 ,并可诱导K5 6 2人红白血病细胞凋亡     

从单个兔B细胞获得抗人cGAS蛋白单克隆抗体

为研究环鸟苷酸-腺苷酸合成酶入核的机制,利用兔外周血B细胞筛选抗人cGAS蛋白单克隆抗体.针对已三次免疫人cGAS(161-522)蛋白的新西兰兔,运用流式细胞术得到阳性效应B细胞,在单管里对单细胞裂解,得到总RNA,逆转录生成cDNA,两步巢式PCR扩增同一个B细胞来源的抗体重链和轻链可变区序列,抗体基因扩增成功率高达80%以上.293T重组表达兔抗人cGAS蛋白单克隆抗体并鉴定,获得1个具有较好结合特异性的兔抗人cGAS蛋白单克隆抗体,ELISA检测结果显示抗体的效价达1∶10 000.     

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。     

人血清免疫球蛋白G的分离及其重、轻链的拆解

用DEAE-纤维素离子交换柱色谱法从人血清中能分离出IgG。以β-巯基乙醇还原和过甲酸氧化两种方法打开IgG分子链间的二硫键,拆离重链和轻链,获得用于免疫试验的特异性重链。     

重组人源抗血管内皮生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

通过优化密码子获得带有信号肽的人源抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体的重链和轻链DNA序列, 分别构建表达载体pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV, 将表达载体共转染HEK 293细胞后, 与C6胶质瘤细胞共培养, 并将所得蛋白进行分离纯化. 实验结果表明: pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV共转染HEK 293F细胞, 可显著抑制C6细胞增殖（P<0.01）; 转染24~144 h后的细胞培养上清液中均有蛋白表达; 所得纯化蛋白和标准品一致; 纯化所得抗体蛋白能明显抑制C6细胞增殖（P<005~001）, 与标准品抑制效果相似.     

重组人源抗血管内皮生长因子单克隆抗体的制备及鉴定

通过优化密码子获得带有信号肽的人源抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体的重链和轻链DNA序列, 分别构建表达载体pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV, 将表达载体共转染HEK 293细胞后, 与C6胶质瘤细胞共培养, 并将所得蛋白进行分离纯化. 实验结果表明: pcDNA VEGFH和pcDNA VEGFV共转染HEK 293F细胞, 可显著抑制C6细胞增殖（P<0.01）; 转染24~144 h后的细胞培养上清液中均有蛋白表达; 所得纯化蛋白和标准品一致; 纯化所得抗体蛋白能明显抑制C6细胞增殖（P<005~001）, 与标准品抑制效果相似.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的克隆、 表达及多克隆抗体制备

利用原核系统表达牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E2蛋白, 制备鼠源多克隆抗体. 通过MDBK细胞增殖病毒, 提取RNA, RT-PCR扩增E2全长基因, 进行生物信息学分析后设计截短引物, 构建优化表达载体pET-30-E2, 转化BL21, 用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达; 用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达, 纯化蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠; 用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价水平, 用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)法验证抗体特异性. 结果表明: E2基因在大肠杆菌中成功表达, 蛋白大小为32 000, 不可溶形式表达, 表达量为0.4 mg/mL; 多克隆抗体效价为1∶256 000, 可特异性结合重组蛋白及细胞中的病毒.     

表达EGFR与HER2双抗体融合蛋白腺病毒载体研究

构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力.通过PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸(Herin)的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2一Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法(IFA)检测所表达的融合蛋白与EGFR(+)Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2(+)的SK-OV-3细胞膜结合的特异性.ELISA检测分析表明,AdS-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/mL-317.3 ng/mL;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合.成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-Herin,而且AT2-Herin蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合.     

表达EGFR与HER2双特异性抗体融合蛋白腺病毒载体的构建及表达

目的：构建携带Cetuximab全长抗体与Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）融合蛋白的腺病毒,探讨其在体外表达情况,及其与EGFR和HER2的结合能力。方法：通过合拉PCR,将抗体cetuximab基因与编码Herstatin C末端79个氨基酸（Herin）的序列融合,构建携带西妥昔单抗全长基因与Herin融合基因的腺病毒穿梭载体pDC339-AT2-Herin,并在293细胞内包装成重组病毒Ad5-AT2-Herin。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Ad5-AT2-Herin表达全长抗体融合蛋白的体外表达量;应用Western印迹法检测所表达全长抗体轻重链的完整性及均衡性;应用间接免疫荧光法（IFA）检测所表达的融合蛋白与EGFR( )Her2(-)的A431细胞,以及EGFR(-)Her2( )的SK-OV-3细胞膜结合的特异性。结果：ELISA检测分析表明,Ad5-AT2-Herin在293细胞中的表达量为209.3 ng/ml-317.3 ng/ml;Western blot显示轻重链表达平衡,大小符合预期;间接免疫荧光(IFA)显示腺病毒表达的融合蛋白与A431细胞表面受体EGFR及SK-OV-3细胞表面受体Her2均能特异性结合。 结论：成功构建携带EGFR和HER2双特异性抗体基因的腺病毒载体Ad5-AT2-Herin,该载体在体外能高效表达双特异性抗体蛋白AT2-HERIN,而且AT2-HERIN蛋白能在体外与EGFR和HER2特异结合。     

鲤IGF2b基因内含子的克隆、基因组序列分析及慢病毒载体构建

 为了了解鲤IGF2b基因与鲤生长性状之间的关系,以建鲤为试验材料,克隆了IGF2b基因内含子,分析其基因组序列的特点,构建了IGF2基因的慢病毒载体,同时观察其在293T细胞中的表达活性。结果获得鲤IGF2b 5 173 bp长度的基因组DNA序列(HM755899),共有3个内含子,4个外显子;在3′非翻译区存在2个CpG岛,在5′端非翻译区存在(T)n重复序列;除此之外,成功构建了慢病毒载体质粒Lenti-IGF2b-IRES-EGFP,转染293T细胞后,产生的重组慢病毒颗粒出现高表达绿色荧光,荧光定量PCR检测发现IGF2b基因在293T细胞中高表达。这些结果将为研究IGF2b基因在多态性、表达方面与鲤生长性状之间的关联奠定基础。     

携人源TPA基因的慢病毒表达质粒的构建与鉴定

利用PCR扩增人源TPA基因,再用酶切-连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-PGK-eGFP中,最后用测序、酶切和在293细胞中瞬时表达的方法进行了鉴定.结果显示：含人源TPA基因的pL-PGK-TPA-eGFP慢病毒表达载体构建成功,为进一步利用转基因技术更加安全高效地生产TPA,治疗血栓类疾病打下基础.     

卵黄抗体的研究进展

自从 1983年 ,Klemperer首次报道鸡蛋中存在抗体以来 ,人们对卵黄抗体 (IgY)的研究越来越多 ,认识也越来越深入 ,应用也日益广泛起来。卵黄抗体价格便宜、制备方便 ,具有其它抗体不可比拟的特点 ,是当今生物科学研究的一个热点。1　IgY与IgG的区别历史上 ,曾经有人认为在禽类血清中发现的低分子量 (MW )免疫球蛋白是IgG。但是研究分析发现禽类血清中的抗体不具有类似于IgG的 5 0kDa重链 (γ) [1] 。所以说禽类血清中的抗体不是IgG。现在认为IgY是禽类血清和卵黄中的主要抗体。IgG的重链 (γ)为 5 0kD ,由四个区域组成 :一个可变区 …     

烟草花叶病毒单克隆抗体的制备和鉴定

经工程菌表达与纯化,得到了纯度95%以上的TMV-CP-F重组蛋白,配合提取的TMV天然病毒颗粒作为免疫原.通过杂交瘤技术获得了14株能分泌特异针对TMV外壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.经鉴定14株细胞所分泌的抗体亚类为IgG1型,抗体轻链均为κ型.经ProteinA一步法亲和层析纯化所得抗体经鉴定相对分子质量在149.36～157.23 ku之间,抗体纯度在80%以上.经间接ELISA测定,14株抗体均与TMV-CP重组蛋白和TMV病毒有良好特异性反应.所制备的抗TMV抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.     

牛肠激酶轻链基因的构建与原核表达

肠激酶作为一种丝氨酸蛋白酶,能够识别顺序-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,水解赖氨酸C端的肽键.根据NCBI中牛肠激酶基因序列(L19663)设计18条引物,通过重叠延伸拼接PCR技术(SOE-PCR)扩增两端带有酶切位点的牛肠激酶轻链基因.构建表达载体pET32a-EK,表达载体转化E.coli BL21 (DE3),利用IPTG诱导表达嵌合蛋白,并用离子交换柱层析纯化肠激酶,获得了高纯度的重组肠激酶轻链蛋白,为大规模生产打下了基础.     

细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达

用RT-PCR方法从人胎肝组织中扩增EpoR胞外区基因及gp130跨膜区基因,并用酶切连接方法将其与抗人AFP嵌合抗体拼接,连接到质粒pVITRO上,构建真核表达载体。将重组质粒转染CHO细胞,以RT-PCR、Western blot和ELISA方法检测融合蛋白的表达。结果显示稳定转染细胞株有约150kDa的融合蛋白表达。