农杆菌介导的抗病基因对番茄的遗传转化

通过农杆菌介导法将含有几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因的双价植物表达载体pBLGC转入番茄子叶外植体。经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了23株卡那霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有7株呈阳性检测反应。通过病原真菌接种试验证明,有3株转基因植株表现出较强的抗病性反应。实验结果为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。     

番茄SlWRKY1转录因子在植物生物和非生物胁迫中的调控

克隆番茄SlWRKY1基因,构建植物过量表达载体pBI121-35S∷SlWRKY1并通过农杆菌介导的遗传转化法转化番茄,成功获得3株过量表达的转基因植株.研究发现:转基因植株对丁香假单胞菌番茄变种(Pst DC3000)的感染表现出敏感性,表明SlWRKY1基因可以减弱由Pst DC3000引起的植物防御反应,在相关信号通路中起到负调控作用.同时SlWRKY1转基因植株对盐胁迫表现出抗逆性,在胁迫条件下转基因植物中积累了大量的脯氨酸.推测SlWRKY1基因可能参与番茄脯氨酸代谢调控.     

番茄转录因子SlWRKY53的分离及生物学功能鉴定

构建番茄SlWRKY53的过量表达载体,通过农杆菌介导转入番茄（Solanum lycopersicum）品种Ailsa Craig（AC+）,获得转基因阳性植株.定量分析显示,这些转基因株系中SlWRKY53基因表达量显著高于野生型.表型分析显示,转基因植株对盐胁迫抗性强于野生型.对抗病性进行检测,转基因植株抗性稍强,但与野生型相比无明显差异.由此推测番茄SlWRKY53基因的过量表达能够一定程度增强植株抵抗盐胁迫的能力.     

番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

AGO1基因对拟南芥叶边缘锯齿状发育的影响

在拟南芥和水稻中Argonaute(AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合体(RISC)的核心组分,在植物叶极性的分化方面具有重要的调节作用。实验根据AGO1基因序列设计一对特异引物,提取野生型拟南芥RNA作为模板,采用反转录PCR方法扩增出AGO1基因,并插入到克隆载体pGEM-T中。筛选鉴定后将AGO1连接到植物表达载体pBI121上,构建起植物表达载体pBI121-AGO1。并且利用农杆菌介导的方法转化拟南芥,通过抗性筛选,获得转基因植株。然后对转基因植株进行表型分析及AGO1蛋白的RT-PCR检测。通过对转基因拟南芥表达分析发现,与野生型拟南芥相比超表达AGO1蛋白的转基因拟南芥叶片明显呈锯齿状,说明AGO1基因影响拟南芥叶片发育。     

番茄SlIWS1基因植物表达载体构建与瞬时表达

番茄是广泛种植的果蔬类作物,病害发生是导致番茄产量和品质降低的重要原因,AtIWS1(Arabidopsis thaliana interact with SPT6)基因可以提高拟南芥抗病性。文章通过病原菌接种克隆番茄SlIWS1基因,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导方法在烟草叶片中进行瞬时表达和Western Blot检测。实验结果表明,番茄SlIWS1基因在病原丁香假单胞菌接种时表达水平升高,参与番茄抗病防御应答。利用SlIWS1基因所构建的植物表达载体,在烟草中获得预期大小SlIWS1蛋白表达产物,可用于后续番茄SlIWS1蛋白质相互作用和基因功能分析。     

番茄紫外损伤DNA结合蛋白2(UV-DDB2)全长cDNA克隆及RNAi载体的构建和转化

人类紫外损伤DNA结合蛋白复合体(UV-DDB)由127 kDa 的DDB1蛋白和48 kDa的DDB2蛋白组成.DDB复合体在核酸损伤修复(NER)过程中起到重要作用.本研究通过RACE技术,获得番茄DDB2的全长cDNA序列(1945 bp),具有一个完整的开放阅读框(160bp),编码的氨基酸序列与拟南芥和水稻的DDB2蛋白分别有65.5%和56.1%同源性.利用半定量RT-PCR技术分析表明,DDB2在番茄根、花、嫩叶和幼嫩的果实等分裂旺盛的组织中表达量较高.同时构建了DDB2基因RNA干扰(RNA interference)载体,并利用根瘤农杆菌介导的番茄转化技术获得转基因植株.     

拟南芥CGP1基因启动子克隆及其GUS转基因植株的构建

前期研究发现一个功能未知基因响应植物镉胁迫,将之命名为CGP1。文章为探究植物基因CGP1的表达模式及其在响应镉胁迫中的表达变化情况,以野生型拟南芥为实验材料构建CGP1基因启动子接pART7-GUS载体及其转基因植株。通过提取野生型拟南芥的DNA,并以DNA为模板利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术克隆得到CGP1基因启动子序列,将启动子序列和GUS载体双酶切后进行连接,并转化到大肠杆菌感受态细胞中,通过测序获得构建成功的ProCGP1-GUS载体。利用浸染花序法将ProCGP1-GUS载体转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选获得ProCGP1-GUS转基因阳性植株,为研究镉胁迫下CGP1基因的功能奠定了基础。     

番茄SlWRKY80基因共抑制表达影响转基因植株抗逆性的研究

利用植物基因工程技术,构建了植物表达载体pBI121-35S::SlWRKY80,并利用根癌农杆菌介导法转化番茄,得到转基因阳性植株.通过生物信息学分析SlWRKY80蛋白序列与9种物种进行同源比对,发现高度保守的WRKY结构域和C2HC型锌指结构.采用Real-Time PCR分析转基因植株中SlWRKY80mRNA的表达情况,结果显示SlWRKY80的表达量显著下调,出现共抑制现象.用不同浓度的NaCl对转基因种子和野生型种子进行胁迫处理,结果显示在NaCl浓度为100mM和150mM时,转基因幼苗初生根的长度与野生型相比相对较短,显示SlWRKY80对初生根的生长有促进作用;用Pto DC3000接种转基因植株和野生型植株叶片,结果显示野生型植株叶片中细菌增殖率是转基因植株叶片中的2.5倍,显示SlWRKY80在番茄抗病信号转导中扮演负调控作用.     

番茄SlCDT1a基因克隆及功能分析

文章通过同源克隆从番茄叶片中克隆到SlCDT1a基因,亚细胞定位结果显示SlCDT1a定位在细胞核中。此外,构建SlCDT1a过表达载体,并利用农杆菌介导法转化番茄得到SlCDT1a过量表达植株。番茄中的CUL4-DDB1-DET1作为泛素连接酶参与许多重要的生长发育过程,包括细胞分裂等。该研究利用免疫共沉淀实验发现SlCDT1a与CUL4、DDB1和DET1均有较强的相互作用,结果表明番茄SlCDT1a基因可能参与细胞有丝分裂;半定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)分析结果发现,SlCDT1a过表达植株T1代中细胞周期Cyclin B基因转录水平明显高于野生型,该结果进一步表明了SlCDT1a在细胞周期中可能起到的关键作用。研究结果为深入理解SlCDT1a在番茄生长发育过程中的作用奠定了重要基础。     

褐飞虱喂养试验显示表达GNA的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有3个不同基因（hpt,gus和gna）的质粒pWRG1515和pRSSGNA1共同转化粳稻品种鄂晚5号成熟胚诱导的愈伤组织。共再生出35株独立转基因植株。PCR／Southern印迹法分析发现,83％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western印迹法分析发现79％的含gna基因的转基因植株以不同水平表达GNA。遗传分析证实外源基因在转基因植株后代中以孟德尔方式遗传。从其R1代亲本为孟德尔3：1方式遗传的R2代中,鉴定出2个含有所有3个外源基因的独立转基因植株纯系。这些纯系具有相似的外源基因表达量。褐飞虱喂养试验表明,这些纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用。这些褐飞虱抗性提高的转基因纯系将应用于水稻抗虫育种中。实验证明,通过遗传转化和筛选可获得含在农业上有应用价值基因的转基因水稻纯系。     

番茄MSI2 like基因的克隆及功能初探

研究通过对番茄MSI2 like蛋白序列与其它模式植物的蛋白序列进行同源性比对, 发现番茄MSI2 like与马铃薯的同源性最高; 另外还预测了其蛋白质的理化性质及三级结构. 酵母双杂交实验证明, MSI2 like与UV Damaged DNA Binding Protein 1(DDB1)具有相互作用. 同时, 利用RNA干涉技术构建植物双元载体, 农杆菌介导法转化番茄得到转基因植株, 该转基因植株在干旱胁迫条件下有一定的抗旱功能. 再利用实时荧光定量PCR分析MSI2 like基因表达的组织差异性, 发现它在各个组织中都表达, 但是在生殖器官花中的表达量明显较其他组织高.     

水稻OsDDB2基因过量表达载体的构建及其转化

利用农杆菌介导法将构建好的水稻OsDDB2过表达载体导入水稻,共获得植株4株,经PCR检测确定4株皆为转基因植株.田间性状分析发现转基因植株的结实率(平均6.05%)远远低于野生型植株的结实率(平均87.4%).相应地,花粉粒I_2-KI染色结果显示转基因植株的花粉数远少于野生型植株的花粉数.这些初步实验结果为进一步研究水稻DDB2基因的功能奠定了基础.     

农杆菌介导的双价抗虫基因对番茄遗传转化的研究

采用农杆菌介导法将含有苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(CryIAc)与半夏凝集素抗虫基因(Pta)的高效植物表达载体pCAMBIA3300转入番茄品系Micro Tom的子叶外植体中。经过共培养、除草剂筛选和分化再生,获得了24个具有除草剂抗性的株系。再将转化后的番茄植株经过PCR检测和Southern Blot检测,确定检测后呈阳性反应的株系为8个。通过小菜蛾幼虫初步抗性试验证明,转基因株系表现出较强的抗虫性。实验结果为进一步研究番茄抗虫性和培育抗虫番茄新品种奠定了重要基础。     

转抗虫融合基因(cry1Ac3-cpti)玉米(Zeamays L.)植株的获得及其抗虫性分析

将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．将苏云金杆菌家族中的cry1Ac3基因与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)融合成融合基因，构建cry1Ac3-cpti融合基因植物表达载体，表达Bt-CpTI抗虫融合蛋白．用基因枪转化技术将cry1Ac3-cpti融合基因分别导入玉米优良自交系E28及340的胚性愈伤组织中，轰击后的愈伤组织经筛选剂3次筛选，获得可育的再生植株．经PCR及Southernblot分子检测，证实所获得的再生植株为转基因植株．抗虫性分析结果表明，部分转基因玉米植株对玉米螟虫有较强的抗性．     

番茄胞嘧啶甲基转移酶同源基因SlMET1功能研究

真核生物中,DNA甲基化作为表观遗传学修饰的重要手段之一,影响了植物的大量生长发育过程。文章通过生物信息学分析确定番茄中的胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)并对其进行进化关系的分析;利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术从番茄cDNA中扩增出胞嘧啶甲基转移酶同源基因(SlMET1)全长,构建SlMET1与绿色荧光蛋白融合表达载体,通过在烟草瞬时表达系统,对其进行亚细胞定位;实时定量PCR分析SlMET1基因在番茄不同组织中的表达模式;同时,构建SlMET1与HA标签蛋白融合表达载体,通过免疫共沉淀分析其与DDB1的相互关系。研究结果表明:SlMET1基因在番茄各个时期和组织中都有表达,其中,叶片和花中表达量较高,在果实的变色期和红果时期表达量较低;通过绿色荧光融合蛋白载体的表达,确定SlMET1基因只在番茄细胞核中表达;通过免疫共沉淀分析确定SlMET1和DDB1之间存在相互作用。该研究为研究DDB1以表观遗传学的方式调控植物生长发育过程奠定了理论基础。     

表达千穗谷Ah-AMP基因的转基因烟草抗病性研究

通过PCR从苋属植物千穗谷(Amarathus hypochondriacus)的总DNA中扩增出苋菜抗菌肽(Ah-AMP)的核基因片段,序列分析结果表明该基因长261bp,编码一个由86个氨基酸组成的Ah-AMP前体多肽.在构建Ah-AMP基因的植物表达载体pBinAH916后,通过根癌土壤杆菌介导方法转化了烟草.转化再生植株和T 1 代转基因烟草的PCR和Southern blot分析表明,Ah-AMP基因已整合到烟草的染色体中,并为单拷贝整合.T 1 代转基因烟草的Northern blot分析结果表明,Ah-AMP基因在转基因烟草中至少在mRNA水平上能正常表达.对T 0 代转基因烟草进行烟草青枯病的抗病性试验,筛选出两株抗性较强的植株.对T 1 代抗青枯病的统计分析发现,其抗病性比起始品种SR1分别提高了2.24和1.62个级别;其病情指数比起始品种降低49.6%和37.3%.对黑胫病也表现一定的抗性,主要表现在推迟发病时间,减缓发病速度上.这些结果表明Ah-AMP基因在植物抗病基因工程研究中可能是一个有潜在应用价值的基因.     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基过量表达载体和RNA干扰载体的构建及遗传转化

构建了含甘蓝型油菜G蛋白β亚基BnGB1基因的过量表达载体pFGC5941-BnGB1和RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Ri-BnGB1,将构建的两个载体分别经根癌农杆菌介导,转化甘蓝型油菜"R197"下胚轴外植体,经过外植体的预培养、共培养以及选择培养后,获得再生植株24株.经PCR鉴定,其中有1株为BnGB1基因过量表达转基因植株,2株为BnGB1基因RNA干扰转基因植株.RT-PCR结果显示,相对于野生型"R197"油菜,过表达转基因植株中的BnGB1基因的表达量提高,而RNA干扰转基因植株中BnGB1基因的表达量降低.