稻瘟病菌限制酶介导整合(REMI)转化的致病性诱变

应用提高直菌转化率的技术－限制酶介质整合（restriction enzyme mediated integration,REMI)技术转化稻瘟病菌株Magnaporthe grisea131原生质体，在限制酶HindIII,KpnI介质下转化效率化效率分别提高6.5,10,3.7倍，通过300μg/mL潮霉素筛选获得1000个以上转化子，用突变体接种水稻鉴别品种，发现其中M25和M36与M131比较其致病性发生了改变，另外还发现产孢缺陷型变体和培养性状发生改变的突变菌株，rep-RCR试验表明REMI突变菌株由于质粒插入而与M131指纹有差异。     

利用限制性内切酶技术获得木霉菌插入变异

利用限制性内切酶介导整合（REMI）技术,通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病（Botrytis cinerea）效果优于初发菌Trichoderma viride T21菌株（初发菌）的3个变异株Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55．变异株本身产生的和诱导番茄植株产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性均比初发菌高,因此,通过REMI技术可以获得新的有益变异株,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平,尤其是提高诱导番茄抗病水平．对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16．9％和89／6,说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果．     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法，用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A．从该蛋白编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段．将所得片段与pMDl8-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂解法提取质粒，通过PCR和酶切分析，筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致．提取质粒，用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（4-）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，构建了人扭转蛋白A原核表达载体．IPTG诱导该工程菌，培养并离心收集．SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达．     

优势黄杆菌对蒽、菲、芘混合物的降解特征研究

为探索混合多环芳烃的生物降解特征，利用两株优势黄杆菌，对混合蒽、菲、芘进行了降解研究．高效液相色谱分析表明，混合多环芳烃的降解56．3％～69．6％在前10h内完成，其生物降解进程和单基质相似，但降解效率低于单基质．混合体系中蒽、菲、芘在不同菌株作用下有按特定优先顺序降解的特征，但两株黄杆菌(FCN1和FCN2)的混合菌并不促进混合多环芳烃的降解．降解130h后，体系中蒽、菲、芘消除，但总有机碳去除率仅达到60．1％～72．7％，说明部分多环芳烃转化为中间代谢产物．菌数测定表明，FCN1和FCN2利用多环芳烃及其降解中间产物繁殖生长，菌数最高时分别增长200倍和100倍，但菌数增长滞后于多环芳烃的浓度变化．研究表明，混合多环芳烃之间具有降解竞争抑制特征，且其生物降解具有规律性．     

栖热菌的DNA转化研究

由栖热菌ＦＤＢ８提取的染色体ＤＮＡ对栖热菌ＦＤ３００９进行了转化。用丝裂霉素Ｃ选择培养基对转化子进行选择，共获得３个转化子。它们的菌落色泽、对丝裂霉素Ｃ的抗性强和耐热ＤＮＡ聚合酶活性均介于供体菌和受体菌之间，而其菌体生长速度和破壁难易程度则优于供体菌和受体菌。结果表明，转化子是由供体菌ＦＤＢ８的染色体ＤＮＡ转化了受体菌ＦＤ３００９所致，同时还可由转化子进一步选育出抗丝裂霉素Ｃ的耐热ＤＮＡ聚合酶高产     

类人弹性蛋白在大肠杆菌中的高效表达

类人弹性蛋白是由VAPGVG六肽重复序列构成的多肽。研究通过全基因合成获得上游引入NcoI和下游引入XhoI限制性内切酶位点的[(VAPGVG)3S]4基因编码序列,通过定向递归连接技术在pMD19-T simple克隆载体中构建[(VAPGVG)3S]32基因编码序列。利用NcoI和XhoI双酶切从重组克隆载体中回收[(VAPGVG)3S]32(ELPs)基因编码序列,在T4 DNA连接酶作用下与NcoI和XhoI双酶切处理的线性化载体DNA分子pET28a(+)重组,重组混合物转化大肠杆菌Top10感受态细胞。从添加有50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆,碱法小量抽提质粒DNA,经酶切及序列测定筛选出序列正确的重组质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。从添加有50μg·mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆至新鲜配制的TB液体培养基中,于37℃、200 r·min-1培养至OD600约为0.60 h,添加终浓度为100μg·mL-1的IPTG诱导类人弹性蛋白表达3 h,SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting分析表明,该研究成功构建了类人弹性蛋白原核表达载体,在IPTG诱导作用下以可溶性状态高效表达。灰度扫描分析显示,重组类人弹性蛋白经IPTG诱导表达3 h后,可达宿主细胞可溶性蛋白的28.3%。该工作为以大肠杆菌为表达宿主,大量制备类人弹性蛋白用于生物医学材料奠定了良好的基础。     

平菇不同栽培方式试验研究

在已长满菌丝的菌袋中，挑选出菌丝长势较均匀的81袋，采用墙式立体覆土栽培、沉袋栽培和塑料袋栽培（CK），进行栽培对比试验，每个处理9个菌袋，重复处理3次，总产量依次为51．1623，48．3732，42．1119kg．前两者产量分别比对照产量提高21．49％和14．87％．不同处理袋产量用新复极差测验，与对照之间的产量差异均达显著水平，而前两个处理之间的产量差异并未达显著水平．     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(I)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法,用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A.从该蛋白编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段.将所得片段与pMD l8-T载体连接,转化到JM l09大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂解法提取质粒,通过PCR和酶切分析,筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致.提取质粒,用BamHI和XhoI酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a( )和pGEX-6P-1中,转化JM l09受体菌,从JM l09受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,构建了人扭转蛋白A原核表达载体.IPTG诱导该工程菌,培养并离心收集.SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达.     

玉米弯孢叶斑病菌ATMT转化条件优化及转GFP单孢的获得

为了明确玉米弯孢叶斑病菌的侵入机理,对农杆菌介导法（ATMT）转化弯孢叶斑病菌的条件进行了探究。以农杆菌AGL-1为侵染菌系、pCAMDGFP作为转化载体。结果表明,玉米弯孢叶斑病菌的ATMT最佳转化条件为：分生孢子萌发12 h后,与农杆菌在25℃黑暗条件下共培养48 h,共培养介质为微孔滤膜。转化效率可达到100～1...     

无污泥持留序批式反应器的脱氮理论模型

提出无污泥持留序批式反应器并建立其动力学理论模型．模型推导表明：反应器的脱氮效能是水力停留时间、曝气比率、进水周期等操作因子的函数；通过调控水力停留时间、曝气比率等因素，能调节反应器的好氧菌筛选因子和厌氧菌筛选因子，完成硝酸菌的洗出和反硝化菌的积累．模型极限分析表明现有Sharon反应器的实质是反应周期为零的无污泥持留序批式反应器．以荷兰Dokhaven污水处理厂的Sharon反应器为例，模型计算结果表明在水力停留时间为2．6d、反应周期为2h、曝气比率为0．175时，厌氧菌筛选因子值为0．020，低于反硝化菌的最大比生长速率0．034，好氧菌筛选因子值为0．093，介于亚硝酸菌最大比生长速率0．137与硝酸菌最大比生长速率0．082之间，此时反应器的理论氨转化率为98．9％，总氮脱除率为97．6％．     

限制性内切酶介导的整合技术

限制性内切酶介导的整合技术是近年发展起来的一种研究基因的新方法,与质粒拯救相结合,可快速分离质粒两侧的DNA序列,进而对该序列做进一步分析和研究．该技术已应用于基因突变、基因标记、寻找新基因等研究领域．本文重点介绍了限制性内切酶介导的整合技术的原理、影响因素及应用现状．     

稻瘟菌致病性变异突变体的筛选及共分离分析

通过筛选稻瘟菌(Magnaporthe grisea)P131小种的REMI(Restriction Enzyme MediatedIntegration)转化体库获得对水稻品种梅雨明致病性变异的突变体,命名为PX1.与野生型菌株P131相比,该突变体对水稻品种梅雨明致病性丧失,在洋葱表皮上侵染钉形成率显著降低,而孢子萌发率和附着胞形成率差异不显著.遗传分析表明,该突变体的突变表型和潮霉素抗性标记共分离,说明突变是由于外源质粒插入引起的,因此,可以此为标记克隆控制该表型的基因.     

卵母细胞老化对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

就小鼠卵母细胞的卵龄对克隆胚的体外发育能力的影响进行了检测,以确定最佳的取卵时间,以及取卵后进行核移植操作的可耐受的时间。采用PMSG和hCG超排B6D2F1雌鼠。在体内老化实验中,分别于注射hCG后13,15,17,20h取卵用于核移植操作;在体外老化实验中,所有的卵均于注射hCG后13h取出并培养,然后在13,15,17,20h进行核移植操作。每个时间点的核移植操作在1h内完成,重构的胚胎培养1h后进行激活。结果显示:在体内老化实验中,注射hCG后13h取卵,获得的克隆囊胚发育率最高,为56.0%,15h取卵仍维持了其支持胚胎体外发育的能力,但17h及更长时间后取的卵,重构后的囊胚发育率显著下降(18.1%)。注射hCG后15h取的卵孤雌发育率最高(囊胚发育率为90.1%),并在17h仍维持较高的孤雌发育能力,在20h显著下降。在体外老化试验中,于注射hCG后13h取卵,分别于13,15,17h重构,都获得了较高的囊胚发育率(分别为57.7%,52.2%,46.3%),而在注射hCG后20h重构,囊胚发育率显著下降(14.8%)。体外老化的孤雌胚在注射hCG后22h激活时囊胚发育率显著下降。结果表明:卵母细胞在体内和体外老化都影响克隆胚的体外发育,最佳取卵时间为注射hCG后13h,取卵后立即用于重构可获得最佳囊胚发育率;体内、外老化卵支持重构胚较好发育的时间间隔是不同的,体内老化卵支持重构胚发育能力从注射hCG后17h开始下降,体外老化卵则发生在20h。这些结果可以指导操作,有利于在应用核移植进行其他基础研究时降低操作引起的误差。     

食品中葡萄糖的酶—比色法分析

用葡萄糖氧化酶和过氧化物酶作酶试剂，苯酚和４氨基安替吡啉作显色剂比色测定食品中的葡萄糖．测定的最大吸收波长为５０５ｎｍ，酶促反应稳定时间４０ｍｉｎ．２４ｈ内重现性好，相对误差小于２％．３２种食品分析确定标准系列范围、称样量．样品测定的不确定度小于０．０９８ｍｇ／ｇ，检出限为０．００３３％．     

氨法处理高炉瓦斯灰制取等级氧化锌研究

以氨-碳酸氢铵混合液为浸出剂浸出高炉瓦斯灰中的有价金属锌,经净化、蒸氨、煅烧得到等级氧化锌,对相关工艺参数进行优化选择。结果表明,最佳浸出条件为:[氨水]/[NH4HCO3]=2、液固比为4、总氨浓度为5mol·L-1,浸出时间为3h,此条件下锌浸出率为82.55%;最佳净化条件为:锌粉用量为1.5g·L-1、净化时间为2.5h,此条件下铅的脱除率为97.70%;最佳蒸氨条件为90℃下蒸氨至终点溶液pH值为6~7,此条件下蒸氨后锌的沉淀率可达99.95%。沉淀物在500℃下煅烧1h,得到纯度为96.03%的氧化锌粉末,达到了HG/T2527—94的一级标准。     

菜青虫体内颗粒体病毒的早期检测

用ＥＬＩＳＡ从感染１６ｈ后的菜青虫血淋巴中检出颗粒体病毒，检出率为４８％，检出率随感染时间延长而递增，感染后２４ｈ高达８０％以上，远早于感染病症出现的时间，用血淋巴检测优于组织提取液，阳性滴度高，以１头虫检测较多头虫好，试验证明ＥＬＩＳＡ比对流免疫电泳灵敏。     

八角茴香油和肉桂油的臭氧化反应研究

八角茴香油和内桂油的臭氧化反应过程受反应控制,传质的影响很小;八角茴香油与臭氧反应６ｈ,反应已基本完全（９５％）茴香醛含量５４．４８（ＧＣ％）,再延长反应时间,茴香醛产量反而下降,肉桂油与臭氧反应１３．６ｈ反应也基本符合（９６％）肉桂醛含量０．３４（ＧＣ％）。     

33例外伤性小肠破裂延迟诊治原因分析

目的：探讨闭合性腹外伤中小肠破裂被延迟诊治的原因，提高其早期诊治水平．方法：回顾性分析1998年3月-2006年3月闭合性腹外伤中，被延迟诊治的33例小肠破裂患者的临床资料．结果：33例小肠破裂患者被延迟诊治最长为11d，最短为26h，平均延迟46h．结论：尽管小肠破裂早期腹部症状不典型，只要认真检查患者，严密观察病情，反复超声监测，腹穿及X光检查，是可以得到及时的诊断和治疗的．     

ESR条件下的微波辐射对小麦种子萌发过程的影响

本文把2个小麦品种(法国和中国春小麦)经浸泡17h已开始萌动的种子暴露于具有特定共振条件的电子自旋共振(ESR)场72h,实验选用的高频电磁场频率分别为v_1=147.9MHz,v_2=53.6MHz,v_3=84.4MHz。实验结果显示,频率为147.9MHz和84.4MHz的ESR高频场对萌发种子胚芽的生长有抑制效应,其抑制峰分别在H_0=2.15A,2.25A处和H_1=3.5V处;而频率为53.6MHz的ESR场对种子胚芽生长则有促进作用,其促进峰在H_1=4.0V。这种依共振条件为转移的ESR生物学效应是一种非热致效应。本工作证实了ESR场对萌发胚芽生长有调控作用。这就从实验方面支持和丰富了Frohlich提出的关于非热致生物学效应机制的理论。     

改性沥青性能指标合理测试时间的确定

通过对不同存储条件下聚合物改性沥青的针入度、软化点、延度和粘度等技术指标的测试,分析了改性沥青各项评价指标随时间的变化规律。结果表明:软化点随时间的延长而降低,低温延度指标则随存储方法的不同而有差异;高温存储的改性沥青改性完成在12 h内,其值随时间增长呈下降趋势,而常温存储的沥青则基本无变化,但12 h后两种方式基本都趋于稳定;为了合理评价改性沥青质量,应在改性沥青成型12 h后再进行性能指标的测试。