The stress response factor RpoS is required for the natural transformation of Escherichia coli

The natural transformation of Escherichia coli is a novel and recently developed system that has significance for genetic studies and the biological safety of genetic engineering. However, the mechanisms of transformation, including development of competence and DNA uptake, are not thoroughly understood. In this study, we demonstrated the effect of the general stress response regulator RpoS, which has been associated with E. coli transformation, on natural transformation performed in an “open system”. We find that RpoS is required for natural transformation but not to artificial transformation and RpoS mainly affect transformation in the liquid culture prior to plating. In the liquid culture, RpoS over-expression promotes natural transformation in early exponential phase and static incubation accumulates RpoS and promotes transformation to a limited extent. These findings provide detailed understanding of RpoS function on natural transformation.     

三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化

描述了一种改良的高效细菌感受态的制备和感受态细胞的保藏及细菌的转化方法.三种不同的大肠杆菌分别是DH5α,TG1和XL1blue,其中最有效的是XL1blue.每种菌株的感受态细胞制备的最佳光密度(OD600值)不同.对感受态细胞的存储时间及其与转化效率之间的关系也进行了研究,结果显示感受态细胞可以在-20℃存储7d,在-70℃存储15d.将常见的方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在质粒对感受态细胞的转化过程中加入DMSO或PEG8000.改良的细菌转化系统比常见的方法能提高转化效率约1000倍,是一种高效的细菌转化系统.     

超声波辐照对大肠杆菌细胞膜的影响

为了解大肠杆菌经超声波作用后其细胞膜的变化状况,采用荧光染料二乙酸荧光素、罗丹明123、二氯荧光黄双乙酸盐对大肠杆菌样品染色,并通过荧光分光光度计、荧光显微镜和透射电镜检测、观察.结果显示:荧光探针测定法可用于测定大肠杆菌细胞膜的变化.在超声波频率为25 kHz、电功率为300W的条件下处理90 s后,细胞结构完整,膜双分子层变模糊,表面有破损成小孔的地方,内含物外渗.膜通透性增加12.7%,膜电位下降26.7%,胞内活性氧水平上升.     

Expression of self-incompatibility ribonucleases of Antirrhinum in Escherichia coli

Self-incompatibility is an intraspecific reproductive barrier to prevent self-fertilization in the flowering plants.In many species,self-incompatibility is controlled by a single S locus with multiple alleles.So far,the only gene known in the S locus of the Solanaceae,Scrophulariaceae and Rosaceae encodes a class of ribonucleases,called self-incompatibility ribonucleases (S RNases),which have been shown to mediate stylar expression of self-incompatible reaction.As the first step to investigate their three-dimensional structure,we successfully expressed three biologically active S RNases of Antirrihnum (S2,S4 and S5) in Escherichia coli (E.coli).Their functional expressions caused no detrimental effect on host bacteria growth and provided a basis for a large scale preparation of S RNase proteins.Possible reasons for non-lethality of S RNases on E.coli are discussed.     

大肠杆菌卷曲菌毛及其致病性

大肠杆菌卷曲菌毛是其菌体表面的一种含纤维素样蛋白质附着器官,出现在大肠杆菌生理和病理过程中,可以通过黏附等作用介导大肠杆菌侵袭宿主.作为一种细菌淀粉样蛋白,卷曲菌毛有可能引起淀粉样蛋白相关疾病;卷曲菌毛可以诱导宿主炎症因子水平升高,引起脓毒血症;卷曲菌毛可以和纤维素等一起构成菌外基质,参与生物膜的形成.基于此,综述了大...     

响应曲面法优化重组人神经生长因子发酵培养基组成的研究

通过响应曲面法(RSM)达到优化重组人神经生长因子发酵培养基组分含量的目的.对发酵基础培养基采用四因素三水平实验设计,优化了葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和KH2PO4的最佳浓度,得到了最大预测值并进行了验证.最终优化培养基组分为:葡萄糖7.95 g/L、蛋白胨19.06 g/L、酵母粉13.51 g/L和KH2PO43.87g/L,此时预测最大菌体量Ymax=2.398 g/L.验证试验结果表明:使用优化后的培养基表达重组人神经生长因子,其菌体量的平均值为(2.357±0.083)g/L,实验值与预测值基本相符,均高于优化前菌体量,且其表达量也得到相应提高.     

豹蛙酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据豹蛙酶的氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计引物,重叠延伸PCR法合成出目的基因,约350bp。将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b(+)中,重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中。转化的重组大肠杆菌用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导外源基因表达,采用Tricine-SDS-PAGE系统,分析目标蛋白主要以包涵体形式存在,其质量分数可达48.8%。利用液相电喷雾串联质谱方式(LC-ESI-MS/MS)鉴定蛋白,通过LCQ DECA XP Plus系统进行蛋白序列的分析,其覆盖率达到35%,确定了其蛋白质一级结构的正确性。     

产丁醇重组大肠杆菌的构建及初步发酵

将丙酮丁醇梭菌ATCC 824丁醇合成途径中分别编码硫解酶(THL)、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(HBD)、巴豆酸酶(CRT)、丁酰-CoA脱氢酶(BCD)和醛/醇脱氢酶(BDH)的关键基因thil、hbd、crt、bcd-etfB-etfA、adhE在大肠杆菌中进行重组表达,构建出3株产丁醇的重组大肠杆菌JM109-99d、DL1346 99d和AFP111-99d。选取摇瓶发酵产丁醇最高(0.52 g/L)的重组大肠杆菌DL1346-99d进行上罐发酵,丁醇产量可达1.07g/L。     

大肠杆菌耐热性肠毒素（ST）的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素（ST）在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁。文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义。     

抗CEACAM5纳米抗体在大肠杆菌中的高效周质表达

纳米抗体具有相对分子质量小、稳定性高、特异性强以及能够穿过血脑屏障等众多优势,而且其能够通过大肠杆菌、酵母等简单微生物大量表达。大肠杆菌周质表达纳米抗体是目前纳米抗体制备主要的方法之一,但是纳米抗体的表达水平还相对较低。以pET22b和pMES4为载体构建了两种重组表达质粒,并且比较了他们在不同宿主菌中表达纳米抗体的情况。结果表明,以pMES4为载体的大肠杆菌能够在周质中可溶性表达纳米抗体,而以pET22b为载体的大肠杆菌表达的纳米抗体无法分泌到周质空间中。随后,通过IPTG浓度优化及5 L发酵罐过程,控制实现了纳米抗体在大肠杆菌周质中的表达量达到308. 32 mg/L。研究提供了一种高效表达纳米抗体的方法,为纳米抗体的规模化制备奠定了技术基础。     

抑制大肠杆菌粘多糖荚膜合成的相关基因的筛选

大肠杆菌(Escherichia coli)通过二信号传导体系RcsC-RcsB能够激活cps(capsule polysaccharide synthesis)基因群,在细胞表面形成一层粘性的保护性荚膜,使大肠杆菌具有较强的致病性。本文通过将基因组文库导入大肠杆菌,筛选到了名为acnA的基因,它编码合成乌头酸酶,在细胞内三羧酸循环和乙醛酸循环代谢中起关键作用,多拷贝的acnA能有效地抑制cps基因群的表达。     

人脂联素在大肠杆菌中的可溶性表达

为了提高重组人脂联素在大肠杆菌中的可溶性,构建和表达了增溶标签与人脂联素的融合表达栽体.这些标签包括大肠杆茵硫氧还蛋白和NusA蛋白、酿酒酵母SUMO蛋白和噬热海洋茵Thermotoga maritime 的红素氧还蛋白.结果显示,所有的人脂联素融合蛋白在大肠杆茵中都获得了高水平的表达,但可溶性存在很大差异,说明不同融合标签对人脂联素可溶性表达的促进作用不同.其中,红素氧还蛋白与SUMO蛋白组合一起对人脂联素可溶性的增强作用最为显著,其相应的融合蛋白几乎全部可溶.另外,通过酵母SUMO/Ulp1反应,经His标签亲和层析纯化得到的人脂联素融合蛋白能被有效酶切,加工为人脂联素成熟肽产物.     

大肠杆菌耐药机制和消除耐药性方法概述

由于广谱抗菌药的滥用以及细菌间耐药基因的转导等因素,导致耐药菌增多,尤其是大肠杆菌对常用抗菌药物耐药的发展越来越令人担忧．本文从大肠杆菌耐药的遗传学机制、生物化学机制和开发新抗菌药物及抑制剂方面的研究进行了综述,提供了大肠杆菌耐药特点及其规律的最新研究进展,从而为防治大肠杆菌耐药的产生及合理用药提供理论依据．     

产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

L-苯丙氨酸是人体8种必需氨基酸之一。酶法转化是目前生产L-苯丙氨酸的主要方法。为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量,对可高效表达苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM105进行培养,对发酵过程中pH值对工程菌生长的影响进行了研究。结果表明,摇瓶培养条件下,控制发酵过程中发酵液的pH值可显著提高菌体产量,当控制pH值为7.0左右时,菌体量比对照高87%。在初始pH值为7.5的情况下,培养10h后将培养液pH值分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,则以pH值为7.5时的菌体量最高。10L发酵罐中控制发酵液pH值为7.5,菌体密度可达A600=20mol/L（DCW=11g/L）,比不控制pH值高出33%。试验结果为进一步开展该工程菌的高密度培养提供了一定的参考。     

陕西省致仔猪腹泻大肠埃希菌的血清型调查

研究了陕西省致仔猪腹泻大肠埃希菌的流行血清型。对分离自腹泻仔猪粪便的131株疑似大肠埃希菌进行生化试验、溶血性试验分析,并对其血清型进行鉴定。121株分离菌符合大肠埃希菌的生化特征,鉴定率为92.37%;有溶血性的菌株占总分离株的81.82%(99/121),其中23株出现β溶血现象,76株出现α溶血现象,22株溶血现象不明显;血清型定型104株,占分离株的85.95%(104/121)。这些定型菌株涵盖了13种血清型,其中O80血清型分离率为28.85%(30/104),O141血清型为19.23%(20/104),O139血清型为9.62%(10/104);O6,O9,O20,O101各有6株;4株及以下的血清型的有O38,O45,O93,O138,O147,O157。血清型O80,O141和O139为陕西省致仔猪腹泻大肠埃希菌的优势血清型。     

大肠杆菌植酸酶appA的融合表达及耐热性研究

提取大肠杆菌(SUGL)基因组DNA,通过PCR方法从基因组扩增得到植酸酶基因ap-pA,测序结果表明该基因的ORF读框包含1440个核苷酸.将该基因重组于大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中,导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌BL21(DE3)-pET32a-appA.对表达条件进行了优化,在30℃下,以0.1mmol/L IPTG诱导表达植酸酶,表达量达到10%以上.在37℃,用钒钼酸铵法测定了表达的植酸酶活性为40740.7U/g,同时观察不同加热温度对植酸酶活性的影响程度.发现融合表达的     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从一株短小芽孢杆菌H9克隆了编码葡聚糖内切酶的基因（该序列已经被已收录于GeneBank,登录号为EF620915）,序列分析表明该基因读码框为1980bp,编码659个氨基酸。预测的酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,第二个结构域为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成。将基因构建在大肠杆菌表达载体pET20b中得到重组质粒pET20b-EglA,将重组载体转化至大肠菌株BL21(DE3)菌株,基因在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达, SDS-电泳图谱表明酶的分子大小约为73KD。     

产辅酶Q10大肠杆菌工程菌的构建

克隆放射型根瘤菌ddsA基因,用于构建red重组的打靶片段,通过同源重组替换大肠杆菌基因组上的ispB基因,使合成辅酶Q8的大肠杆菌具备合成辅酶Q10的能力.通过强化辅酶Q合成过程中的ddsA、ubiA、ispA、idi等关键酶基因,可使大肠杆菌辅酶Q10的合成能力提高126.9%.综合分析表明,ddsA与ubiA为辅酶Q10合成的关键基因,ispA与idi为辅酶Q10合成的次关键基因.     

肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

通过电击转化法，将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K88、K99中，经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光，表明gfp加基因得到稳定、高效的表达．进一步通过PCR分子鉴定、血清型鉴定、微生物学特性分析均表明，转化菌株与原始菌株是一致的．该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益生素的筛选提供有效的手段．     

ubiCA基因的强化表达及对大肠杆菌辅酶Q生物合成的影响

为调查大肠杆菌高产辅酶Q(CoQ)的可能性,首先研究大肠杆菌生物合成关键基因ubiCA强化表达对大肠杆菌CoQ产量的影响。本文构建了含有ubiCA基因的5个表达质粒,将其分别转入E.coli JM 83或BL 21(DE 3)菌株中,定量分析这些转化子的辅酶Q产量。结果表明ubiCA基因在ubiC自身启动子(pub iCA-lacZF)介导下的表达最有效,重组菌CoQ产量达到对照的3.5倍,由此推测ubiCA基因的表达可能与其启动子序列有关。