人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中，利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中，利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子，通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明，酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上，并且得到了预期的表达。     

突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM-CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM-CSF，具有毒副作用小等优点，鉴于非糖基化的hGM-CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM－CSF活性更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM-CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现该突主型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM-CSF的活性。     

抗菌肽SMAP-29在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母密码子偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,克隆到表达载体pPIC3.5K上,SalI线性化后转化毕赤酵母GS115,418抗性筛选高拷贝克隆,再由酵母菌落PCR鉴定;阳性克隆用甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导第2d的酵母裂解液中检测到与预期的SMAP-29分子量接近,约3.2kD的诱导表达带;Trizol法提取酵母总RNA,并通过RT-PCR扩增SMAP-29mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在SMAP-29mRNA,而对照没有检出,表明SMAP-29在毕赤酵母中存在表达。     

重组人细胞色素P450 2C9在毕赤酵母中的胞内表达

以含有CYP2C9基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板,并在人细胞色素P4502C9的5’端插入kozak序列及3’端6×His标签进行PCR扩增,克隆至真核表达载体pPIC3.5K,利用电激法将经Sal I线性化的重组质粒pPIC3.5K-2C9转化至毕赤酵母GS115中,通过抗性、表型和PCR筛选多拷贝整合株,甲醇诱导毕赤酵母GS115/pPIC3.5K-2C9的表达,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物.结果表明:含有重组质粒的重组pPIC3.5K-2C9表达了大小为55KD的目的蛋白,与预期大小相符,说明人细胞色素CYP2C9可在毕赤酵母的胞内表达.     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F＇中,提取质粒测序,证实序列正确.再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋自在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达.     

野生革耳菌漆酶cDNA在巴斯德毕赤酵母中的表达

将分离到的野生革耳菌(Panusrudis)漆酶的cDNA序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建成受强启动子AOX1控制的重组表达载体.重组质粒DNA经BglII线性化后,电击转化毕赤酵母GS115细胞,通过G418筛选和PCR鉴定的重组酵母在甲醇诱导后能分泌表达活性漆酶.低温培养是该漆酶基因活性表达的必要条件.培养基中添加400μmol/L的CuSO4最有利于漆酶的活性表达.     

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg~(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg~(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg~(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

人Cu,Zn-SOD在酵母系统中的表达

甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）是一种理想的真核蛋白高水平表达系统。将人Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ基因克隆到酵母整合型质粒载体ｐＰＩＣ３．５Ｋ，经转化ｈｉｓ４缺陷型酵母ＧＳ１１５，用ＭＤ培养基及ＰＣＲ方法筛选阳性转化子，并用含Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基筛选多拷贝转化子，经甲醇诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹杂交结果证实了表达产物为重组的人Ｃｕ，Ｚｎ－ＳＯＤ，经计算机扫描分析，表达量占酵母可溶性     

天蚕抗菌肽B在毕赤酵母中的表达

Cecropins B是一种昆虫抗菌肽,具有分子量小,热稳定性、水溶性好、抗菌谱广等优点,更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用,仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。根据毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)偏好密码子,改造并化学合成天蚕素基因B,克隆到pPIC9K载体中,构建分泌型重组酵母表达载体CB-pPIC9K,转化Pichia pastoris受体菌KM71,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,Cecropin B获得表达,分子量约3.8KD,摇瓶发酵产率可达到200μg/mL,并对其抗菌活性进行了初步测定。结果表明我们表达的重组Cecropins B对G-菌有较好的抑菌活性,且具有较好的热稳定性。这些特点使得重组抗菌肽Cecropins B在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot 分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13 μg/mL.     

α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达

为避免α-葡聚糖造成的制糖过程中的糖分损失、制炼难度增加以及糖产品质量下降,利用α-葡聚糖酶分解而直接去除α-葡聚糖是目前最佳的选择.文中扩增了α-葡聚糖酶基因dex,构建组成型表达载体pGAPZαA-dex;以毕赤酵母KM71H为受体菌,将表达载体整合进入受体菌基因组,构建了组成型表达α-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌.摇瓶发酵120h,α-葡聚糖酶酶活达到60.4U/mL,从而实现了α-葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达,使发酵过程无需使用甲醇进行诱导,提高了生产和使用安全性.     

甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘，然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中，用G418筛选高拷贝菌株，并进一步对其进行PCR鉴定，获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h，SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin，其大小约为11ku，并具有甜度。     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达

构建3株表达凝乳酶的重组毕赤酵母,通过甲醇诱导收集BMMY液体培养基上清后,通过Arima K方法分别对其进行酶活测试并进行酶学性质分析.结果表明,GS115/pPIC9K-chy1菌株诱导7d后,其酶活达到1.905SU/mL重组凝乳酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH为6;在pH 4~7之间凝乳活性相对稳定;在50℃以下可以保持酶活,在55℃处理50min后,丧失60%的活性.     

复合干扰素在毕赤酵母中的表达与纯化

根据复合千扰素的氨基酸序列和毕赤醉母密码子偏爱性,利用重叠延伸PCR的方法合成复合干扰素DNA序列,克隆至分泌型醉母表达载体pGAPZαA,线性化后经高效电转化、Zeocin筛选鉴定及培养条件优化,获得了重组复合干扰素高表达菌株pGAP-conIFN/GS115,重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中.培养液上清经盐析、凝胶过滤和阴离子交换层析进行纯化,最后用分子筛脱盐.SDS-PAGE分析显示,纯化后的目标蛋白纯度可达到92%左右,比活性可达5.5×108 U/mg.     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.