抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法，从人脑ｃＤＮＡ库中克隆ＦＨＩＴ基因，扩增得到５５３ｂｐ片段克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ载体，测定了其ＤＮＡ序列。该序列包括ＦＨＩＴ ｃＤＮＡ编码区全部４４４ｂｐ，以及５‘端５２ｂｐ和３’端５７ｂｐ非编码区序列。编程区有二处位点发生突变，第９２位密码子中的Ｃ突变成Ｇ，是同义突变，不导致氨基酸改变；     

SpltNPVp49基因的克隆和序列分析

根据新发现的杆状病毒凋亡抑制基因ｐ４９基因的序列设计了一对引物,以ＳｐｌｔＮＰＶ基因组ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ扩增获得了预期大小的约１．３ｋｂ的ＤＮＡ片段,将此片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上并直接测序。序列分析表明,该片段为ＳｐｌｔＮＰＶ完整的ｐ４９基因开放读码框。与已知的杆状病毒ｐ４９基因的序列同源性为８７％,与之对应的氨基酸序列的同源性高达９３％。它是首次从ＳｐｌｔＮＰＶ中克隆到的抑制细胞凋亡的     

大熊猫核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的cDNA克隆及序列分析

为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps26基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基基因rps26的异同,以大熊猫的肌肉组织为材料,根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S26亚基基因(rps26)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,成功地克隆了核糖体蛋白亚基基因rps26的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果表明:大熊猫rps26亚基基因的表达序列长为413 bp,开放阅读框(ORF)为348 bp,编码115个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为13.025 2×103,等电点为11.61.拓扑预测显示该蛋白含有3个功能位点:1个N-糖基化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ蛄姿峄?位点和1个核糖体蛋白S26e signature位点.进一步分析发现,大熊猫rps26基因与已报道的人、西藏黄牛、野猪、褐家鼠和小家鼠5个哺乳动物物种的表达序列其编码的氨基酸序列具有很高的相似性:编码序列同源性分别为90.23%、91.67%、92.82%、87.36%和86.78%;氨基酸序列同源性均为99.86%.     

川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊的PRLR基因序列设计引物,以川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及进行序列分析,以期为进一步研究该基因与山羊的繁殖性能奠定理论基础.结果表明:川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区均长1746bp,均编码581个氨基酸.川中黑山羊(金堂类群)PRLR基因编码区与藏山羊、绵羊、牛、牦牛野猪和人的同源性分别为99.71%、99%、95%、95%、83%和80%.以核苷酸序列构建分子系统进化树,川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类,再与绵羊聚为一类,后与牛和牦牛聚为一类,然后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.     

五指山猪生长激素基因全序列克隆及序列分析

通过筛选一对引物，PCR扩增五指山小型猪GH基因全序列，并进行克隆测序分析、序列分析及氨基酸分析．结果表明，有98个位点不同，同源性为95．026％，外显子有2个碱基发生了突变，其中外显子2有1个位点的碱基突变导致了氨基酸异义取代。     

小儿肺炎并发心肌损伤心肌钙蛋白I的检测意义(附46例分析)

目的:探讨小儿肺炎并发心肌损伤心肌钙蛋白I的检测意义。方法:采用全自动化学免疫系统检测4 6例肺炎患儿心肌钙蛋白I(CTnI)、肌酸激酶同功酶(CKMB) ,并与2 6例正常小儿进行对照比较。结果:肺炎患儿与正常小儿CTnI、CKMB值比较均有非常显著性差异(P <0 0 1) ,且肺炎越重,越易造成心肌损害,二者值越高。两两比较,除重症肺炎组与普通肺炎组CKMB差异无显著性外(P >0 0 5 ) ,其余均有非常显著性差异(P <0 0 1)。结论:CTnI可作为监测小儿肺炎并发心肌损伤的重要标志物。     

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1 E基因的5'端克隆及部分序列分析

根据国外报道的JEV(Japanese encephalitis virus)基因组全序列,针对JEV E基因5'端设计合成一对特异引物,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA 为模板,经RT-PCR扩增,获得366 bp的JEV E基因cDNA片段.将此片段重组于质粒pUC 19中,并转化大肠杆菌DH5α.经PCR扩增,酶切及序列分析,结果表明JEV M73-1 5'端126个核苷酸序列与JEV日本Nakayama株和JaOArS 982株的同源性分别为96.8%和96.8%,氨基酸序列同源性均为99.2%.通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了1973年在呼和浩特市流行的脑炎是由JEV引起的流乙脑炎.E基因编码JEV的囊膜糖蛋白,是其重要表面抗原.JEV M73-1 E基因5′端克隆和部分序列分析对JEV的分子生物学研究、建立分子生物学诊断技术以及基因工程疫苗的研制均具有重要学术意义和实际价值.     

小菜蛾泛素基因的克隆及序列分析

设计了一对简并引物,从小菜蛾Plutella Xylostella(L.)抗溴氰菊酯品系和敏感品系的雌雄成虫基因组中分别克隆了泛素基因的编码区,GenBank登录号分别为EU28778,EU28779,EU28780,EU28781.序列分析表明,该基因的长度为228bp,编码的多肽由76个氨基酸组成.不同品系和不同性别的小菜蛾泛素基因的核苷酸序列、氨基酸序列等均存在差异,其中敏感品系雌雄成虫间差异较大,序列相似性为81.1%;抗性品系雌雄成虫间差异较小,序列相似性为97.8%.推测这些差异可能与小菜蛾抗药性的形成有关.因而为进一步研究小菜蛾抗药性形成机制和遗传机理奠定了基础.     

蓖麻PsbO基因的克隆与序列分析

用实验室栽培的蓖麻新鲜叶片为材料,Trizol法提取总RNA,参照GenBank公布的植物PsbO氨基酸序列,进行序列比对找出氨基酸序列保守区设计简并引物,通过RT-PCR扩增目的片段,纯化后克隆到T-Vector中测序,获得蓖麻的PsbO基因,对其基因序列进行分析。了解到其长度为1081bp,5＇非编码区为10bp,3＇非编码区为273bp,编码区长798bp,编码266个氨基酸。序列分析结果表明,蓖麻PsbO基因编码的氨基酸序列与已公布的其他植物中克隆到的PsbO氨基酸序列有较高的同源性。     

白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析

通过分析多种已知的毒蛇蛇毒类凝血酶（SVTLEs）基因序列同源性,以保守的N和C末端氨基酸序列设计引物,克隆得到白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）SVTLE基因并分析其序列。以毒腺总RNA为模板进行RT—PCR,纯化并克隆至pMD18-T。结果表明,该酶基因大小为777bp;推测出其相应氨基酸序列含258个氨基酸残基,分子量为28．02kD,pI值为6．07;其3个可能糖基化位点为NDT103～105、NNS121～123和NRT251～253;与其它毒蛇的已知SVTLEs基因比较分析,推测出其含6对二硫键即Cys31—162、Cys50-66、Cys98．256、Cys142—210、Cys174—189和Cys200—225;其催化活性中心氨基酸残基为His65、Asp110和Ser204。分子进化树分析表明,毒蛇SVTLEs一级结构的进化具有一定种属特征,可为蛇的系统分类提供参考。     

半夏属植物凝集素基因片段克隆与序列分析

半夏属植物凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,有3个甘露糖专一结合位点,且具显著的抗虫性.本研究根据已知掌叶半夏凝集素基因表达序列的相关信息设计引物,采用RT-PCR方法,分别从滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏中克隆出长约530bp的凝集素基因片段.使用Genescan软件、ORF finder软件、Ex2PASy Proteomics Server软件对5个凝集素基因片段进行分析,结果表明:克隆出的滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、掌叶半夏、三叶半夏凝集素基因片段分别编码107、171、170、170、170个氨基酸,在它们所编码的肽链中,都具有酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和N-糖基化位点三类不同的功能位点.但由于编码序列碱基的突变,引起肽链中的氨基酸发生变化,从而导致这五种植株的凝集素基因存在较高的多态性以及存在功能位点的差异.其凝集素基因多态性及功能位点的差异对凝集素功能的影响需进一步分析.本实验为克隆五种植物凝集素基因的表达序列与结构基因以及深入研究半夏属凝集素的功能提供了有意义的参考资料.     

茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶基因克隆、序列分析及原核表达

以茂原链霉菌(Streptomyces m obaraensis)的基因组DNA为模板,利用PCR的方法扩增出谷氨酰胺转胺酶(Transglutam inase,TGase)的完整基因片段.序列分析结果表明,该片段全长1 246 bp,包含一个完整的ORF,长度1 146 bp,编码395 aa,分子量为44 kD左右.该基因的核酸序列及推导的氨基酸序列同已知微生物来源的若干TGase相比,序列相似性均很高,并且发现与酶催化活性有关的一些motif,如酰胺化位点等;在此基础上,又进一步对其二级结构进行分析并完成了TGase三维结构的建模.将编码TGase酶的基因片段插入到原核表达载体pQE30Xa中,并转化大肠杆菌(E.coliJM109).SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导后该基因得到表达,表达产物的酶活为2.2 U/mL.     

稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因 cDNA 克隆及组织表达分析

铜蓝蛋白(Ceruloplasmin,Cp)是一种重要的铜转运蛋白,合成于肝脏并参与生物体铁的代谢,在医学上是各种炎症、感染、中毒及癌症疾病的标志性蛋白.铜蓝蛋白的研究已在多种真骨鱼类中被报道,文中第一次在稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)中报道此基因.采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因,使用荧光定量PCR的方法构建了该基因组织表达谱.序列分析表明稀有鮈鲫铜蓝蛋白基因包含3 264bp全长编码序列,该序列编码1 087个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与斑马鱼同源性最高(分别为88.1%和90.3%).理论相对分子质量和等电点分别为124 429.1D和6.41.荧光定量PCR检测表明该基因在肝脏和脾脏中相对表达量最高,在肌肉和鳃中相对表达量最低.使用氨基酸序列进行蛋白结构保守域分析,结果表明铜蓝蛋白基因在脊椎动物中是相对保守的,推测其功能也与其他物种相似.这为进一步研究稀有鮈鲫该基因的功能及其应用奠定了基础.     

心肌肌钙蛋白I-C复合物酶联免疫检测方法的建立

为了制备抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单克隆抗体、建立检测人cTnI链酶亲和素-生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,用基因工程表达的人cTnI免疫雌性BALB/c小鼠,以杂交瘤技术制备得到三株特异性抗人cTnI的单克隆抗体记为6G3,6A6,3G9.三株杂交瘤细胞中6G3和6A6为IgG1,3G9为IgG2b,腹水效价分别为4×10-5,4×10-5和10-5.亲和常数为5.0×109,6.4×109和3.8×109mol-1.Westernblotting结果表明6G3和6A6能够识别cTnI-C复合物.把6G3抗体生物素化并制备抗cTnI、cTnC和cTnI-C的大鼠多克隆抗体.以多抗作为固相捕捉抗体,生物素化6G3抗体作为检测抗体,建立检测cTnI的双抗体夹心ELISA方法并初步应用于临床病人标本检测.以cTnI-C复合物多抗捕捉检测方法具有良好的灵敏度、特异性和准确性,灵敏度为0.9ng/mL,较包被其他抗体捕捉方法提高1~2倍.批内变异系数为5.03%,回收率为94.56%.测定17例AMI病人和18例血清样本临床诊断结果符合率为100%.     

家蚕质多角体病毒基因部分序列克隆及分析

根据BmCPV(Bombyx mori cytoplasmic polyedrosis virus)核酸片段4的末端序列设计一对引物，通过RT－PCR扩增获得多条DNA片段，对其中占优势的约740bp的片段进行切胶回收，克隆到pGEM-Teasy载体上并进行序列测定。与GenBank中的database比较分析表明，该序列与已登录的序列同源性很低，并与呼肠弧病毒科其它种的对应核酸序列有较大差异。本实验证明所测序列为一新序列。