VSV-G假型反转录病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在新生血友病B小鼠中的有效转移和表达

研究探索了VSV-G假型反转录病毒invivo途径基因治疗血友病B的可行性.采用新型包装细胞系293-GPG制备了VSV-G/G1NaBAⅨ假型病毒,该病毒的最高滴度可达8.5×108CFU·mL-1,与传统的反转录病毒相比具有更高抗补体灭活效应(P<0.001),并初步证实了新生鼠血清补体对VSV-G假病毒的灭活作用明显弱于成年鼠血清补体(P<0.01).不同剂量的病毒上清液经腹腔注入新生血友病B鼠后,各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原,最高峰值为(72.5±6.1)ng·mL-1,表达持续超过120d.治疗后小鼠的凝血功能均有一定程度的改善,以大剂量治疗组的改善最为明显,凝血活性提高至(3.4±1.5)%,APTT时间缩短至(43.6±7.2)s.hFⅨ的表达水平和凝血功能的改善程度与所用病毒的剂量呈正相关.治疗小鼠体内未检测到抗hFⅨ抗体,未发生任何治疗相关的毒副反应和生殖细胞的基因转移.研究结果表明,采用VSV-G假型反转录病毒开展新生血友病B小鼠invivo基因治疗是可供选择的有效方法.     

甲型流感病毒H7N9血凝素单克隆抗体的制备及保护性研究

以H7N9甲型流感病毒(A/Shanghai/2/2013)全病毒灭活疫苗原液为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗甲型流感病毒H7N9血凝素(HA)的单克隆抗体.通过ELISA和血凝抑制(HI)试验初步筛选单克隆抗体,筛选后的Ig G类单克隆抗体用中和试验检测其中和活性.将有中和活性的单抗通过小鼠体内法大量制备腹水,腹水经亲和层析柱纯化后进行特异性及稳定性检测.同时在小鼠模型中进行了HA单克隆抗体抵抗同源流感病毒感染的预防性和治疗性实验,通过观察小鼠的症状并统计小鼠的存活率、体重变化和肺部病毒滴度等指标发现单抗6A3在预防性和治疗性实验中都可以有效地抵抗H7N9流感病毒的感染.显著降低肺部病毒滴度,对小鼠提供100%的保护.甲型流感病毒H7N9血凝素单克隆抗体的成功制备为进一步研究H7N9流感病毒血凝素的抗原表位及治疗诊断试剂的开发奠定了基础.     

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.     

光敏剂AIPCS对新城疫病毒光动力学失活的初步研究

80年代有人注意到光敏剂能致一些含囊膜的病毒产生光失活作用,试图应用这一原理灭活血制品中的病毒污染物.如血卟啉     

修饰天花疫苗对付狂犬病

法国科学家正在研究一种新的对付狂犬病的疫苗.在小鼠试验似乎表明用基因工程生产的疫苗安全、有效而且易于给药.Transgènce小组决定使牛痘病毒携带狂犬病毒的基因.若为狂犬病毒抗原蛋白基因编码是典型的.那么体内产生的抗体将阻止狂犬病毒在体内的生存.Transgènce小组和费城Wistar研究所以及Strasfoury Inserm公司的研究人员发现:要使以上理     

从灭活病毒诱导的培养细胞中鉴定鱼类抗病毒相关基因

紫外线灭活的草鱼出血病病毒(GCHV)能诱导鲫鱼囊胚培养细胞(CAB)产生高滴度的干扰素并抵抗病毒入侵, 其机制可能是通过诱导一组抗病毒相关基因的表达, 而使寄主细胞建立起抗病毒状态. 利用抑制性差减杂交技术, 构建了灭活病毒诱导鱼类培养细胞基因差异表达的差减cDNA文库. 从差减文库中筛选鉴定出272个差异cDNA片段, 测序分析发现它们为69个基因, 其中46个为已知基因的同源物, 23个为未知的假定基因. 已知基因包括Ⅰ型干扰素信号通路的基因Stat1和Jak1, 抗病毒基因Mx和Viperin, 以及一系列干扰素激活基因或免疫相关基因. 23个未知的假定基因多数具有富含AU成分的序列. 虚拟Northern杂交和RT-PCR进一步证实这些基因在灭活病毒诱导的细胞中差异表达. 意味着灭活GCHV不仅能诱导CAB细胞分泌干扰素, 而且还导致一系列重要抗病毒相关基因或免疫相关基因的表达, 揭示鱼类干扰素系统的信号转导途径和抗病毒机制与哺乳类基本相似.     

利用反向遗传学技术获得适应RK13细胞的兔出血症病毒

在前期构建的兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)全长cDNA分子的基础上, 利用SP6 RNA聚合酶系统, 在体外转录合成了病毒RNA. 用转染试剂将病毒RNA导入RK13细胞, 12 h后可见明显致细胞病变(CPE), 用间接免疫荧光方法在RK13细胞中检测到了病毒抗原的产生. 将收获的细胞培养物再次接种RK13细胞, 仍然能产生明显病变. 大量收取细胞培养物, 经差速离心法纯化病毒后, 在电子显微镜下可观察到RHD病毒粒子. 结果表明, 利用反向遗传学技术获得了可适应于RK13培养的RHDV, 为将来研究RHDV的分子致病机理和新型疫苗等提供了有利的工具.     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒全长可读框的表达及其产物免疫原性分析

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)全长约为6.9 kb的可读框(ORF)克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中, 构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-ORF. pVL-ORF与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 经空斑筛选后成功获得携带有FMDV全长ORF的重组病毒Bm-ORF. 免疫荧光技术证明, 重组病毒能够正确表达插入的外源基因. 将获得的重组病毒Bm-ORF感染家蚕5龄起幼虫, 双抗体夹心ELISA法和电子显微镜观察证明, 目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳. 用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫牛, 免疫动物均产生了特异性抗体. 免疫后21 d进行病毒攻击保护实验, 获得了2/4的完全保护.     

打疫苗,安全不安全?

疫苗是什么?疫苗是将细菌、病毒等病原微生物,经过人工减毒、灭活等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。当人体接触到这种不具伤害力的病原菌后,免疫系统便会产生如免疫激素、特殊抗体等保护物质。所以,当人体再次接触到这种病原菌时,自身的免疫系统便会依循其原有的记忆,制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。     

纳米材料作为重大疾病疫苗载体或佐剂的研究进展

目前,研究开发出安全性好且能有效刺激机体细胞免疫和体液免疫的疫苗及其载体和佐剂是绝大多数传染病疫苗研发中的瓶颈问题.鉴于病毒载体疫苗潜在的安全性问题,近年来DNA疫苗和亚单位疫苗如蛋白质疫苗等新型疫苗逐渐成为重大疾病防治研究的热点.然而DNA和蛋白质较难进入机体且易被酶降解导致了疫苗较差的免疫原性.要解决这些问题需借助于合适的疫苗载体或佐剂.可用于人体的两种佐剂(铝佐剂和MF59)主要激活机体的体液免疫,对细胞免疫的调节作用较弱,这对于预防和治疗胞内病原体如病毒等的感染显然是不够的.作为非病毒载体,纳米材料具有较好的生物相容性和独特的理化性质,如易于加工修饰、促进功能分子入胞、保护DNA和蛋白质等免受降解,在疫苗载体或佐剂的研究与开发过程中逐渐成为关注的热点.目前,已有一些纳米材料在实验动物水平显示出较好的载体作用或佐剂活性.本文将总结分析纳米材料作为载体或佐剂的研究进展与应用前景,为更加科学合理地设计纳米材料用于疫苗领域提供参考.     

一种新型的低辅毒污染的重组AAV生产系统

将Cre-loxP系统引入重组AAV的生产过程之中, 用缺陷型腺病毒AdLC作为生产重组AAV的辅助病毒. 在大量生产带有目的基因(EGFP, hFⅨ )的重组腺相关病毒载体的同时, 最大程度地限制了辅助病毒的产生, 从而减轻了下游纯化工作的压力. 活体动物实验的结果证实了这种方法的优越性. 实验结果为重组AAV载体系统在基因治疗领域中的应用提供了一条新的途径.     

恶性疟原虫DNA疫苗的初步研究

采用遗传工程技术克隆了编码含有恶性疟原虫子孢子期及红内期表位的基因片段，与霍乱毒素Ｂ（ＣＴＢ）亚基基因或白介素２（ＩＬ２）基因融合基因的重组质粒。将纯化的质粒免疫Ｂａｌ ｂ／ｃ纯系小鼠，３次免疫后诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫，抗ＣＴＢ抗体滴度平均为１：１２８０，抗ＮＡＮＰ及抗ＡＷＴＥ抗体平均滴定为１：１０００，免疫的小鼠进行疟原虫子孢子攻击实验，保护率在５０％左右。     

艾滋病疫苗研究的新进展

一种理想的艾滋病疫苗，必须具有快速决定性的进攻能力。它所产生的免疫细胞，将消灭受感染细胞并激发艾滋病病毒束缚抗体，以及抑制艾滋病病毒的感染。由美国蒙大拿大学杰克·H·努伯格领导的研究小组，现已研制出一种对艾滋病、至少是用在实验鼠体内的可行疫苗，该疫苗可使免疫系统慢慢地隐匿有效抗体，从而对艾滋病病毒的传染性产生令人惊奇的抑制作用。该疫苗具有某些缺憾，似乎还不益使用于人体。但是，它提供了人体艾滋病疫苗应能够激发有效中和抗体的论据，从而使人联想到该疫苗似乎具有论据所提示的那种能力。在概念论证上，如果结…     

治疗性抗体药物发展现状及展望

抗体是机体对抗原刺激发生反应,由浆细胞产生的一种免疫球蛋白.它能特异性地识别相应的抗原物质并与之反应.抗体是体内最奇妙的分子,有巨大的多样性.任何被人体免疫系统视为"异己"的外源性物质,如细菌、病毒或毒素等,都能引起机体产生抗体,从而发挥预防和治疗疾病的作用.     

单克隆抗体技术

1975年,科勒(Khler)和米尔斯坦(Milstein)证明,小鼠骨髓瘤细胞和用羊红细胞事先免疫过的小鼠脾细胞经过融合,可以从中获得分泌抗羊红细胞同源抗体的杂交体。这种杂交细胞可以在体外连续培养并产生大量的同源抗体。因为这个技术的基本环节在于淋巴细胞之间的融合,故称为“淋巴细胞杂交瘤技     

几个免疫相关的丝氨酸蛋白水解酶的神经生长因子活性

用江浙蝮蛇毒中分离纯化得到的具有高神经生长因子活力的蛋白———神经生长因子样蛋白水解酶免疫家兔 ,得到抗血清 .初步分离抗体并以此抗体为配基制备了亲和柱 .江浙蝮蛇粗毒经过该亲和柱分离并进一步经FPLCMonoQ柱层析得到几个不同组分 ,其中含量较高的组分Ⅱ和组分Ⅲ分别被纯化 .组分Ⅱ ,组分Ⅲ与神经生长因子样蛋白水解酶的N端序列均与蛇毒中的丝氨酸蛋白水解酶高度同源 ,而且三者均具有不同高低的蛋白水解酶活力 .但是 ,它们的NGF活性却不同 ,其中神经生长因子样蛋白水解酶的NGF活力与NGF相当 ,而组分Ⅱ也略有NGF活力 ,组分Ⅲ则完全不具有NGF活力     

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测

构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 10¹² vg(病毒基因组)/mL. 将rAAV/hFⅨ病毒以7.5 × 10¹¹ vg/只直接注射到血友病B小鼠股四头肌中, 检测到人Ⅸ因子最高表达量达到387 ng/mL血浆, 持续表达时间12周. 血浆中产生的抗体情况与表达曲线相吻合. 实验结果表明, 采用HSV/AAV杂合辅助病毒法能够有效解决AAV载体的大量制备问题, QC-PCR法检测重组腺相关病毒的滴度比传统的点杂交法更加快速准确. RT-PCR检测表明重组AAV中没有野生型HSV的污染, PCR检测表明重组AAV注射后, 重组AAV病毒仅存在于注射点附近的肌肉中, 未见扩散.     

中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku富半胱氨酸基因的克隆、表达及其编码蛋白定位

应用RT-PCR扩增中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白通读区(readthrough, RT) 5′端(RTn)和3′端(RTc)及19 ku的富含半胱氨酸蛋白基因, 分别克隆并在E. Coli中表达, 表达蛋白粗提纯后免疫小鼠, 制备相应的抗血清和单克隆抗体. 用各种抗体检测小麦病叶汁液中RTn, RTc和19 ku蛋白. 结果表明, RTn和RTc分布在病叶细胞中的CWMV病毒粒子表面, 而19 ku蛋白则均匀分布于细胞质中.     

疫苗的革命

疫苗的发明者英国医生詹纳首次把天花患者的脓液直接接种到健康人的身体上。其后,人们便将灭活了的毒素或死了细菌、病毒作为疫苗而采用。最近,疫苗开发的技术进步——疫苗革命是特别值得谈的。新技术之一是采用只让大肠杆菌或酵母制造病毒蛋白质,即利用大肠杆菌或酵母的方法。采用该法时,由于利用基因操作可以把多种病毒蛋白质合而为一,因此用一次接种便可产生对多种疾病的免     

Vero细胞培养传代后的2株SARS冠状病毒基因组序列变异分析

RNA病毒在复制时有易出错的倾向, 因此SARS病毒在传染或传代过程中易发生突变而产生不同的毒株, 这种机制也利于病毒逃脱宿主的免疫系统而生存下来. 许多研究也表明, 不同的SARS病毒分离株的全基因组序列存在不同程度的差异, 这些差异的研究无疑对SARS病毒疫苗的研制具有重要的指导意义. 同时, 对SARS病毒在传代过程中的遗传稳定性及核酸特性的分析, 是SARS疫苗研制不可或缺的环节. 采用PCR产物直接测序的方法, 对2株用Vero细胞培养经过多次传代的SARS病毒进行了全基因组序列的测定, 通过比较分析发现该病毒在传代过程中具有高遗传稳定性, 其中检定参比株(Sino1株)2和11代全基因组序列比较有4个碱基的变化, 而候选疫苗株(Sino3株)3与10代的基因组全序列仅有1个碱基的差异. SARS病毒在Vero细胞上传代的遗传稳定性表明, 以此制备的灭活病毒疫苗是稳定的.