程序性细胞死亡配体1胞外区原核重组表达、纯化及其多克隆抗体制备

为制备程序性细胞死亡配体1胞外区多肽及其鼠源性多克隆抗体,根据UniProtKB数据库中公布的其胞外区基因序列(标识符:Q9NZQ7-1)和原核表达载体pET-28a(+)Nde I上游和Xho I位点下游的序列,设计合成带有同源臂的特异性引物.以合成的PD-L1胞外区基因为模板,PCR扩增程序性细胞死亡配体1胞外区基因并将其克隆至pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-PD-L1-E,转化至大肠杆菌DH5α中,扩增并提取其质粒,然后将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达.亲和层析镍柱纯化重组蛋白后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,确认表达蛋白正确.浓缩换液后用重组蛋白免疫Balb/c品系小鼠制备多克隆抗体,经ELISA检测,成功获得抗程序性细胞死亡配体1胞外区血清.该研究对于研发某些肿瘤伴随诊断检测试剂有重要意义.     

牦牛病毒性腹泻病毒P20和P14蛋白基因的原核表达及其产物检测

以牦牛BVDV基因组DNA为模板, 运用聚合酶链反应首次成功扩增出牦牛BVDV P20及P14基因, 并将其插入到pET-28a原核表达载体, 构建重组表达质粒pET-28a-P20和pET-28a-P14并分别转化至Rosetta(DE3)和BL21(DE3) 宿主菌中, IPTG诱导表达, 经SDS-PAGE检测, pET-28a-P20在宿主菌Rosetta(DE3)和BL21(DE3)中表达出约26KU的融合蛋白, pET-28a-P14表达出约20KU的融合蛋白, 结果分析表明p20和p14蛋白在两个宿主中都获得了高效表达, 表达出的蛋白大小与预期结果相符.     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

原核系统表达的鸡白细胞介素-10的鼠抗血清体内研究的初步分析

目的获得鸡白介素-10(chIL-10)的原核表达产物,制备鼠抗血清,分析与真核系统表达的chIL-10的反应原性。方法采用RT-PCR从经脂多糖(LPS)体外刺激的鸡外周血淋巴细胞中扩增编码成熟IL-10的基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+),成功构建原核重组质粒pET-chIL-10;转化至大肠杆菌DH5α中IPTG诱导表达,切下含有重组蛋白的SDS-PAGE胶条,免疫制备鼠抗血清;分别与包含信号肽和去除信号肽的chIL-10真核表达细胞系CHO-euchIL-10F和CHO-euchIL-10M进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(Western blot),验证有无反应性。结果成功构建chIL-10的原核表达载体pET-chIL-10,获得了高效价的鼠抗血清,能与表达chIL-10的真核细胞系反应。结论原核表达的chIL-10特异性鼠抗血清将能用于体内研究的检测。     

小龙虾钙结合蛋白基因表达及纯化

从小龙虾(Procambarus clarkii:pc)的肌肉组织中提取其总RNA,设计特异性引物,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)克隆出编码小龙虾钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein:SCP)基因片段,扩增片段为582 bp.该序列与已报道的几类虾SCP序列比对结果表明:在氨基酸水平上同源性为81%～96%.将SCP基因与pET-28a载体连接,构建了原核表达载体pET-28a-peSCP重组质粒,转化E.coli BL21(DE3),经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为22 kDa,与预期的相对分子质量大小相符.并用Ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化,得到了纯度较高的pcSCP.研究重组蛋白peSCP的获得,为pcScP变应原性及相关的研究奠定基础.     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.     

人溶菌酶N端与Exendin-4嵌合蛋白的基因克隆及原核表达

目的:克隆嵌合多肽人溶菌酶N端-Exendin-4基因并进行原核表达和纯化.方法:通过重组PCR技术将人溶菌酶N端74个氨基酸的基因序列与Exendin-4多肽基因序列相连接,其间引入一段由凝血酶和二肽基肽酶识别位点组成的连接序列.以嵌合基因hLYZ(N74)-Ex4与质粒pET-32a(+)构建原核表达体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达.表达蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、Western blotting鉴定;透析复性后,以肠激酶切割并回收目的多肽.结果:重组质粒pET-32a/hLYZ(N74)-Ex4构建正确,目的蛋白主要以包涵体形式存在,37℃诱导4h、IPTG浓度为0.6 mmol/L时表达量最高,约占菌体蛋白总量的30%.Western blotting检测显示重组蛋白为单一清晰条带.重组蛋白经肠激酶切割后,回收得到高纯度的嵌合多肽.结论:成功构建hLYZ(N74)-Ex4嵌合基因的原核表达质粒,高效原核表达并获得高纯度目的蛋白.     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

菠菜43 kD叶绿素a结合蛋白编码基因克隆及原核表达条件优化

将菠菜43 kD叶绿素结合蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒pET-28a-psbC转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导实现了外源基因的可溶性表达.探讨了含组氨酸标签融合蛋白的最佳表达条件(包括表达单克隆、时间、温度对表达的影响).利用Ni2+-Sepharose 4 Fast Flow亲合层析纯化出His-apo CP43蛋白.体外重组实验证实 His-apo CP43能特异结合叶绿素a,经过温和电泳分离纯化所得体外重组色素蛋白复合物具有与提取自类囊体膜的天然CP43相似(但不完全相同)的荧光特性.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

人RACK1基因的克隆及原核表达

克隆人RACK1基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-RACK1,诱导表达重组蛋白,纯化后Western blot鉴定目的蛋白.根据GeneBank提供的RACK1基因序列及pET-30a(+)载体上的多克隆位点设计引物,以人胎肝cDNA文库为模板,钓取RACK1cDNA全长序列.将目的片段与原核表达载体pET-30a(+)连接,转入E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆.将测序正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导表达,利用镍柱对表达的蛋白进行纯化,Western blot法检测纯化的蛋白.结果显示,克隆得到的目的基因序列与GeneBank中已报道的序列完全一致,成功构建了pET-30a(+)-RACK1原核表达载体.重组蛋白主要以包涵体形式存在,经镍离子亲和层析柱纯化后,Western blot检测证实纯化的蛋白能与特异性的抗体发生反应.本研究获得了人RACK1蛋白,为深入研究RACK1的功能奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的表达与纯化

根据GenBank报道的PRRSV VR2332基因序列设计引物,经RT - PCR扩增,得到大小约为390 bp的阳性产物;利用Bam H Ⅰ,EcoR Ⅰ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE,Western blot分析.结果表明:克隆的N蛋白基因与GenBank报道的VR2332基因同源性为93.83％;重组菌株经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;经筛选得到最佳诱导条件,即1 mmol/L IPTG诱导6h,蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635％,SDS-PAGE后切胶回收可得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础.     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及免疫原性分析

利用PCR技术扩增了SHV-12 ESBLs目的基因,并将目的基因亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-28a-SHV-12转化于表达菌株BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳分析.结果表明,目的蛋白SHV-12 ESBLs相对分子质量为30 KDa,经蛋白质印迹检测证...     

灵芝免疫调节蛋白LZ-8基因的克隆与表达

灵芝能够调节和增强机体免疫力,具有极高的药用价值;LZ -8蛋白是最早被分离研究的免疫调节蛋白,它不仅是灵芝生命活动的重要物质而且具有独特免疫原性.实验采用CTAB法提取灵芝基因组DNA,PCR扩增全长lz -8基因;利用XbaⅠ,XhoⅠ位点将lz -8编码基因片段克隆到原核表达载体pET -28a中,构建原核重组表达质粒pET -lz8,转化BL21(DE3)并进行SDS - PAGE及Western - blot分析.结果表明:克隆的lz -8基因与GenBank报道的序列同源性达到87.5%～100%;重组菌株经IPTG诱导后,lz -8基因得到了高效表达,目的蛋白表达量可达菌体总蛋白的36.52%.     

头孢菌素C酰化酶S12在不同原核系统中的表达

目的：构建头孢菌素C酰化酶（Cephalosporin C Acylase）基因的两种原核表达载体,确定高效原核表达体系。方法：人工合成头孢菌素C酰化酶S12基因,分别克隆到含有Lac启动子的载体pBC KS和T7-lac启动子的载体pET-28a上,命名为pBC-S12和pET-28-S12,重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）,表达纯化目的蛋白S12,测定酶活。结果：成功地构建了头孢菌素C酰化酶S12的原核表达菌株,组成型表达和诱导型表达体系的表达量低,目的蛋白具有酶活,诱导型表达产生的酶比组成型表达产生的酶具有更强活性,可作为大肠杆菌表达头孢菌素C酰化酶的高效表达体系。     

粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位的克隆与表达

目的 :构建表达粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)基因的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法 :用PCR方法从霍乱弧菌中扩增CTB片段 ,将其转入原核载体质粒pET-32a( ) ,在大肠杆菌Top10克隆 ,并在BL21中表达。结果 :重组质粒PET-CTB的全长序列经分析与基因文库公布的一致 ;表达蛋白经SDS-PAGE分析 ,相对分子量与文献相符 ;重组蛋白竟Westernblot检测有抗原性。结论 :基因重组菌表达的CTB蛋白可能作为有效、安全的粘膜佐剂用于口服疫苗的研制     

ChIFN-γ基因植物表达载体的构建与瞬时表达

 为了使鸡干扰素-γ（ChIFN-γ）基因在油菜中获得高效表达,优化了油菜偏爱的密码子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加内质网滞留信号肽SEKDEL.应用同尾酶将人工合成的ChIFN-γ,Napin特异性启动子及信号肽与NOS终止子克隆到质粒pSH中构建成植物表达载体pSH-NGN.经生菜瞬时表达,ELISA检测表明ChIFN-γ蛋白获得有效表达.研究结果为进一步遗传转化油菜奠定了基础,同时也对构建基因的正确表达提供了一种新的快速鉴定方法.     

GST和His标记的重组蛋白制备及吸附纳米ZnO的研究

以pET-28a(+)载体为模板人工设计引物,通过PCR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine)序列的目的基因片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,筛选及鉴定阳性重组子pGEX-His,转化E.coli BL21细胞后通过IPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)和6聚组氨酸标记的重组蛋白GST-His得到表达,利用Ni-NTA系统进行纯化.通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定,由LC-MS/MS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.     

幽门螺杆菌hpaA基因克隆及其蛋白的表达纯化

目的克隆幽门螺杆菌hpaA基因,构建hpaA-pET-32a重组质粒,并对其重组蛋白进行表达纯化,为其进一步的免疫研究提供实验基础.方法采用PCR方法,从幽门螺杆菌临床分离菌株中扩增hpaA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,通过表达载体pET-32a构建的hpaA的重组质粒,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,最后对重组蛋白进行纯化.结果重组质粒hpaA-pET-32a经双酶切、PCR及测序证明构建成功,经诱导重组蛋白成功表达,以包涵体蛋白的形式存在,对其纯化后获得了高纯度的重组蛋白.结论成功构建幽门螺杆菌hpaA的原核表达系统,并对其重组蛋白进行了表达纯化.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.