抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体P^Bin438经HindⅡ和EcoPⅠ双酶切,回收其HindⅡ－BmaHⅠ-Sal-EcoRⅠ片段和P^UC19HⅢ-EcoRI片段连接,构建成载体记为P^UC38。将含AFP基因的克隆经BamHI,XhoⅠ双酶切,得到的BamHI-AFP-XhoⅠ片段装入P^UC38BanHI-SalⅠ位点,克隆AFP基因。然后再用HindⅢ、EoR1双酶切AFP基因,插入P^Uin438的HindⅢ-EcoRⅠ位点,进而构建成带有AFP基因的植物表达载体,为进一步研究AFP基因在植物中表达奠定了基础。     

鸡γ－干扰素表达载体的构建

采用PCR方法从peDNA-ChlFN-γ重组质粒中扩增得到鸡γ-干扰素基因.将目的基因定向克隆进能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE lxisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株.以IPTG诱导表达8xHis-tag 标签蛋白并对其进行纯化,通过SDS-PAGE检测方法表明,ChlFN-γ基因片段成功表达.     

胸腺素α原基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

胸腺素α原(ProTα)作为一种免疫增强剂,对各种免疫缺陷疾病、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用.此外ProTα可以作为核蛋白参与细胞增殖,在肿瘤的预测、诊断及治疗中有一定应用.根据人胸腺素α原已发表的核苷酸序列,设计了一对特异性引物(P1/P2),应用RT-PCR法从中国人外周血中克隆到ProTα基因,将扩增产物连接到pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组质粒进行序列测定;同时用EcoRI和BamHI双酶切PCR产物,将该基因片断插入经同样双酶切的质粒pGEX 6P-1中,转化大肠杆菌BL21中进行表达.结果表明,克隆到的ProTα基因与参考的氨基酸同源性为99.70%;原核表达产物经过SDS-PAGE电泳分析,融合蛋白分子量为37 ku,主要以可溶形式存在.     

按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α-2b基因编码区的核苷酸序列,应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段,经互补片段分别退火和连接后,将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中,进行DNA序列分析,分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组.获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α-2b基因.     

Chi-linker-Glu融合基因双价植物表达载体的构建及其相关鉴定

将木霉几丁质酶基因Chi和β-1,3-葡聚糖酶基因Glu通过8个中性氨基酸连接起来,形成Chi-linker-Glu融合基因．其中编码区基因长2376bp,共编码792个氨基酸和一个终止子．将该融合基因克隆到中间载体pAHC25中,然后将整个ubi-chi-linker-glu-nos表达盒插入用ubi-bar-nos表达盒代替CaMV35S-gus-nos的高效植物表达载体pBI121中,构建了双价抗真菌基因的重组质粒pBIb-CG,并通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草．PCR扩增和PCR-Southern分析证明已将Chi-linker-Glu融合基因整合到烟草基因组中．     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

hIL-2／IFN-1嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL 2 /IFN γ 嵌合基因原核表达质粒 ,筛选其高效表达工程菌 ,设计特异性引物 ,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEXHTb质粒NcoⅠ /HindⅢ位点 ,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆 ,IPTG诱导工程菌后以SDS PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况 ,并测定其抗原性和生物学活性 ,结果成功构建了工程菌Top10F’[hIL 2 /IFN γ],经优化表达条件后 ,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的 30 % ,分子质量约为 34ku .ELISA和Western blot实验结果表明 ,目的蛋白能特异性结合抗IFN γ 抗体 ,呈阳性反应 ,生物学活性测定显示其IL 2和IFN γ 比活性分别为 1 7× 10 7U/mg与 3 2× 10 6 U/mg .     

扁豆几丁质酶基因的克隆及表达

以扁豆总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增到长度为885 bp的扁豆几丁质酶基因cDNA,其编码294个氨基酸,目的蛋白的分子量为28.429 kDa.以该基因构建pET-21a-chi表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.30℃下,用0.1 mmol.L-1IPTG,诱导5 h,表达产物的酶活力为36.25 U.mL-1.通过常压Sephadex G-50凝胶过滤色谱,DEAE-650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化.目标蛋白达到电泳纯(SDS电泳一条带),几丁质酶的比活力108.42 U.mg-1.表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在.     

酵母α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中,重组质粒pRSET-Gal转化至相应的受体菌BL21（DE3)）PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析,在50kD处有一目的分子大小的亮带,裂解细菌后经X-α-Gal的显色底物反应,液体变蓝．试验表明：α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的。     

按大肠杆菌高表达序列设计的入干扰素α—2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α—2b基因编码区的核苷酸序列，应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段，经互补片段分别退火和连接后，将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中，进行DNA序列分析，分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组，获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α—2b基因。     

化学合成的α-降钙素基因相关肽基因在大肠杆菌中的融合表达及产物分离纯化

化学法合成的α－降钙素基因相关肽基因从pXZ101表达质粒转移到pUC18质粒中测序鉴定后,克隆到pGEX表达载体上,在大肠杆菌C600中表达．融合蛋白经谷胱甘肽亲和层析初步纯化,用凝血酶切去融合蛋白,经SephadexG－50柱纯化后,用溴化氰裂解,再经SephadexG－25柱纯化后得到纯品CGRP．经ELISA反应及放射免疫鉴定具有生物活性;经末端氨基酸测定与设计的一致．动物活体实验证明,大肠杆菌中表达的蛋白有降压活性．     

泛素和PR1a信号肽融合基因植物表达载体的构建

泛素（Ubiquitin）融合蛋白策略在近年来已被应用于在植物中提高外源蛋白的产量。信号肽（Signal Peptide）使外源蛋白定向运输到细胞内的特定部位。本研究是在植物高效表达载体pBin438的基础上,采用三引物PCR法（TP-PCR）技术,将拟南芥（Ambidopsis）泛素基因与烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽序列体外重组;并将重组的融合基因定向克隆到植物表达载体pBLG中,获得了含有泛素和PR1a信号肽序列的植物表达载体pBLG-UP。这为进一步验证外源基因在植物体内的高效表达奠定了基础。     

α2b干扰素基因与Ag85B基因在毕赤氏酵母中的融合表达

Ag85是结核分枝杆菌的一种分枝菌酸转移酶复合体,在结核分枝杆菌的细胞壁合成过程中起着重要作用Ag85B是该复合体的一个组分,具有较好的免疫原性通过连接多肽（G4S）4的编码序列,将α2b干扰素基因与Ag85B基因连成融合基因,然后克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9上,转化Pichia pastoris SMD1168后获得重组酵母工程菌SMD1168／pPIC9-α2bAg85B,经甲醇诱导培养,发酵上清液经抗病毒活性测定,Western blot鉴定以及初步纯化,结果表明,分泌表达的融合蛋白具有一定的抗病毒活性．     

hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒的构建与表达

为构建hIL-2/IFN-γ嵌合基因原核表达质粒,筛选其高效表达工程菌,设计特异性引物,PCR扩增目的基因并克隆至pPROEX HTb质粒Nco Ⅰ/HindⅢ位点,经双酶切及序列测定筛选阳性克隆,IPTG诱导工程菌后以SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达情况,并测定其抗原性和生物学活性,结果成功构建了工程菌Top1O F'[hIL-2/IFN-γ],经优化表达条件后,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的30%,分子质量约为34 ku.ELISA和Western-blot实验结果表明,目的蛋白能特异性结合抗IFN-γ抗体,呈阳性反应,生物学活性测定显示其IL-2和IFN-γ比活性分别为1.7×107U/mg与3.2×106U/mg.     

人α－干扰素基因在小菜蛾细胞中的表达及其影响因素探讨

将含有人α－干扰素（ＩＦＮα）基因的杆状病毒转移载体（ｐＡｃ３７３－ＩＦＮα）与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ经钙磷沉淀法共转染小菜蛾细胞系（ＢＣＩＲＬ－Ｐｘ２－ＨＮＵ３,Ｐｘ）,空斑纯化后,利用细胞致病效应（ＣＰＥ）抑制法检测得到了干扰素效价（６８７２．６ＩＵ）,证明得到了可以在Ｐｘ细胞中表达ＩＦＮα的重组病毒（Ａｃ－ＩＦＮα）．并探讨了培养温度和血清浓度对ＩＦＮα表达水平的影响,结果表明：在２８℃时,培养基中补加２％的小牛血清,可获得最高的ＩＦＮα效价（１７４３５．９ＩＵ）．     

草鱼生长激素基因的克隆及原核表达研究

应用RT-PCR技术从草鱼脑垂体总RNA中克隆草鱼生长激素cDNA(cGH)，全长669bp，含开放阅读框633bp，编码210个氨基酸，分子量为23．6kDa，等电点为6．28；与已报道的草鱼GH有12个碱基、3个氨基酸残基的差异，同源性为98％．将草鱼cDNA定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，构建了重组草鱼GH基因质粒pGEX-GcGH，经IPTG诱导，pGEX-GcGH在大肠杆菌中可表达49．6kDa的融合蛋白．     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

果实特异表达芪合酶基因的表达载体构建及农杆菌重组

本研究利用基因工程技术构建了附加果实特异表达启动子的芪合酶基因植物表达载体，并通过农杆菌直接转化技术将其转入LBA4404、EHA105，并采用PCR及限制性酶切分析对所获得的农杆菌工程菌株进行鉴定。为利用芪合酶基因转化植物并在食用果实中产生白藜芦醇做准备。     

产甘油假丝酵母中α-磷酸甘油酯酶的表达特征

α-磷酸甘油酯酶催化甘油生成的最后一步反应的酶，该酶具有高度的底物专一性。本文研究了甘油发酵动态过程中该酶的表达情况与甘油的产量和残糖之间的关系，发现在整个甘油发酵过程中，该酶在36h处出现峰值，随后就逐步下降。