北京鸭肾脏间充质干细胞对LPS诱导小鼠急性损伤免疫反应的研究

探讨北京鸭肾脏间充质干细胞对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠急性损伤的免疫反应.用LPS对小鼠进行腹腔注射,制作急性组织损伤模型,用北京鸭肾脏间充质干细胞对小鼠进行腹腔注射.实验结果表明,LPS诱发炎症反应后,取对数生长期能分泌一定抗炎物质且生长增殖活力旺盛的间充质干细胞注入小鼠体内,可显著降低TNF-ɑ和CRP水平,调节促炎因子IL-4和IL-10对炎症的应答反应,说明间充质干细胞对急性炎性反应有一定的作用.     

黏附因子-1、IL-18在大鼠左心缺血再灌注诱导的急性肺损伤中的作用

目的:探讨白介素-18、黏附因子-1在左心缺血再灌注肺损伤中的作用及对呼吸功能的影响.方法:60只SD大鼠随机均分为实验组和对照组,实验组复制左心缺血再灌注肺损伤模型并与BL-420生物信号采集分析系统相联,对照组不做左冠状动脉的前降支结扎其余操作同实验组.比较缺血30min、再灌注30min、再灌注60min3个时间点两组大鼠肺组织白介素-18、黏附因子-1表达情况、外周血和支气管肺泡灌洗液中白介素-18水平、动脉血氧分压及呼吸曲线进行比较.结果:各时间点实验组大鼠肺组织白介素-18、黏附因子-1表达高于对照组;外周血和支气管肺泡灌洗液中白介素-18水平高于对照组;PaO2低于对照组;呼吸曲线的幅度、强度、持续时间均低于对照组,上述差异均具有统计学意义(P<0.05).结论:白介素-18激活黏附因子-1释放增多,吸引白细胞在肺循环发生黏附聚集释放反应,引起炎性细胞因子的进一步释放,导致肺炎症反应失衡,引起急性炎症损伤,致呼吸功能下降.     

神经元素3蛋白(Ngn3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素表达细胞分化的初步研究

胰腺发育相关基因神经元素3（neurogenin3,Ngn3）,属于碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）家族的转录因子,对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要,且被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白质．之前的研究发现,全长Ngn3蛋白具有蛋白质转导功能,可以高效进入多种真核细胞系．近年来多项研究显示,骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞．利用蛋白质转导技术,将体外表达纯化的胰腺发育重要因子Ngn3蛋白导人体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞中,诱导其向胰岛素表达细胞分化．结果显示,经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞出现细胞聚集生长现象,并有形状类似胰岛的细胞团出现．RT-PCR结果显示经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞可以有效表达胰岛素,并且一些β细胞相关基因如胰十二指肠同源盒基因-1（pancreatic-duodenal homeoboxl,Pdx-1）,神经分化因子（neurogenic differentiation,NeuroD）,同源结构域基因4（pairedboxgene4,Pax4）,葡萄糖转运体-2（gluoase transporter2,Glut-2）都有表达．细胞免疫荧光也可检测到胰岛素的表达．通过Ngn3蛋白质诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞的初步研究,探索了应用骨髓间充质干细胞体外诱导分化获得胰岛素表达细胞的可行性,为糖尿病治疗提供一定的实验依据．     

体外分离培养的心脏干细胞具有间充质干细胞的特性

近年来,已报道从成年的小鼠中分离得到心脏干细胞(Cardiac Stem.Cells CSCs),并且应用于心脏病的治疗.但是心脏干细胞特征尚未完全阐述.通过体外分离成年小鼠的心肌组织,进行培养,分离得到半悬浮状态的具有干细胞特性的细胞;利用流式细胞仪检测分离得到的心脏干细胞的表面分子表达情况;并且通过调整培养条件诱导其体外分化.研究结果显示成功分离得到的心脏干细胞,表达干细胞标志分子Sca-1,以及间充质干细胞标志分子(CD29、CD90、CD44和CD106);体外分化研究显示心脏干细胞可以分化成心肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和成骨细胞.心脏干细胞具有间充质干细胞的特性,具有多向分化潜能,在心脏损伤的治疗中具有重要意义.     

肥胖与非肥胖小鼠间充质干细胞成脂分化

分离培养瘦素受体基因突变型(db/db)和野生型(Wild Type,WT)小鼠原代间充质干细胞(Mesenchymal StemCells,MSCs);采用油红O染色和异丙醇萃取法分析不同分化时期细胞中脂质积累和成脂诱导率;免疫印迹检测PPARγ和脂联素蛋白水平。结果表明,db/db小鼠MSCs通过下调脂联素和PPARγ的表达抑制成脂分化过程;db/db小鼠和WT小鼠的脂肪细胞分化过程存在差异。     

人足月胎盘间充质干细胞的分离纯化及其特征

目的:从人足月胎盘中分离、培养间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特征.方法:将人足月胎盘组织经胶原酶Ⅱ消化和贴壁培养法获取间充质干细胞,运用活细胞计数和碘化丙啶(PI)检测其增殖能力;采用流式细胞术检测其细胞表面标志的表达;用地塞米松、抗坏血酸及β-磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用Yon Kos-sa染色进行鉴定;用地塞米松与胰岛素诱导其向脂肪细胞分化,并以油红O染色进行鉴定.结果:从人足月胎盘分离的间充质干细胞为梭形贴壁细胞,增殖能力较强;强表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR;经诱导后向脂肪细胞及成骨细胞分化,油红O染色、Von Kossa染色为阳性.结论:人足月胎盘中也富含间充质干细胞,与其他来源的间充质干细胞的生物学特征相似,可能是组织工程新的干细胞来源.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞.方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs 表达酪氨酸羟化酶.在镜下,观察MSCs 在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达.结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应.结论: SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞.     

全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

目的：探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（ＭＳＣs）向胰岛β样细胞分化。方法：在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化。观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞。结果：未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应：双硫腙染色阳性。结论：人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增和向神经细胞定向诱导分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞,在体外不仅可以分化为间充质类细胞,而且可以分化为非间充质类细胞.研究了人骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件.从骨髓中分离MSC,用MesenCult培养基进行纯化和扩增培养.每扩增一代,细胞数量增加约2～3倍,在体外扩增12代后扩增约4.6×10 4 倍;诱导不同扩增代数的MSC向神经细胞分化,诱导后的细胞平均有80%以上呈现典型的神经元样表型.免疫组化法检测发现,神经元样细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶,组织化学法检测观察到神经元特有结构尼氏体,表明MSC在体外具有向神经细胞分化的潜能.     

miRNA在人骨髓来源间充质干细胞成骨诱导分化过程中的表达

观察miRNAs在人骨髓来源间充质干细胞成骨诱导分化过程中的表达情况。以从骨髓中分离培养的MSCs及成骨诱导培养后的细胞为实验对象,利用基因芯片检测miRNAs的表达情况,由SAM分析得到MSCs较其诱导培养细胞中差异表达的miRNAs,再进行生物信息学分析。分离培养出的MSCs经成骨诱导培养14 d后,已具有成骨细胞特性;经芯片检测并SAM分析,成骨诱导培养的细胞较MSCs高表达的miRNAs有7个:hsa-miR-363*、hsa-miR-483、hsa-miR-590、hsa-miR-130a、hsa-miR-15b、hsa-miR-30c、hsa-miR-663;成骨诱导培养的细胞较MSCs低表达的miRNAs有6个:hsa-miR-192、hsa-miR-210、hsa-miR-128a、hsa-miR-224、hsa-miR-106a、hsa-miR-494。利用TargetScan预测其靶基因,并行生物信息学分析,其中hsa-miR-130a、hsa-miR-15b和hsa-miR-30c的预测靶基因多为维持干细胞特性的基因;而hsa-miR-106a和hsa-miR-494的预测靶基因多为参与骨形成及成骨分化的基因。为证明miRNAs参与调控MSCs的成骨分化过程提供了直接证据和研究基础。     

过表达IL-8受体对脐带源间充质干细胞生物活性的影响

目的探究腺病毒介导的IL-8受体过表达对脐带源间充质干细胞生物活性的影响。方法本研究利用含有IL-8RA和IL-8RB的c DNA和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒载体(p Ad-IL-8RA-GFP、p Ad-IL-8RB-GFP和p Ad-Null-GFP)分别转染分离培养的P3-5代脐带源间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测干细胞标签蛋白CD29、CD44、CD34、HLA-DR的表达,CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力,粘附实验及Transwell趋化实验观察过表达IL-8RA/B的脐带源间充质干细胞的迁移能力。结果脐带源间充质干细胞形态均一、生长状态良好;干细胞特异性相关蛋白CD29、CD44阳性表达,CD34、HLA-DR阴性表达;与对照组比较,IL-8RA/B过表达的脐带源间充质干细胞的增殖能力无明显改变,但是过表达IL-8RA/B的间充质干细胞粘附在损伤内皮上以及迁移到小室下方的细胞数目更多。结论以上结果表明IL-8RA/B的过表达不影响脐带源间充质干细胞的增殖能力,但是能够促进脐带源间充质干细胞向IL-8趋化和向损伤内皮细胞粘附。     

小鼠胎肝间充质干细胞体内向骨骼肌样细胞分化的研究

目的:了解小鼠胎肝间充质干细胞在体内向骨骼肌细胞分化的潜能。方法:无菌条件下将C57BL/6 J胎鼠肝脏制成单细胞悬液,雄性胎肝悬液体外贴壁培养纯化,传3代后将贴壁细胞移植于心肌毒素(card iotoxin)造成的雌鼠骨骼肌损伤部位,2月后处死受鼠,取相应骨骼肌组织固定、制片;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝间充质干细胞向骨骼肌样细胞分化情况。结果:在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时呈现骨骼肌组织的部分特征,表型为desm in /F lt-1-/CD4-5/F4-/80。结论:胎肝中分离出的间充质干细胞在体内可以分化为骨骼肌样细胞。     

脐带源间充质干细胞的生物学性状及其成脂肪细胞诱导分化

以健康产妇脐带为材料分离脐带间充质干细胞,体外培养扩增传代,做细胞形态观察,计数细胞并绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪测定细胞周期以及免疫表型,测定细胞定向诱导分化成脂肪细胞的能力.发现人脐带源间充质干细胞能在体外培养扩增,可定向诱导分化为脂肪细胞并且具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物学形态和抗原表型.成功建立了脐带源间充质干细胞系,可以作为干细胞研究和应用的新的材料来源.     

慢性砷暴露诱导小鼠肺结构损伤和免疫失衡

以C57BL/6雄性小鼠为受试动物,研究慢性饮水砷(As)暴露对肺的损伤效应。小鼠摄入含5 mg/L或50 mg/L As的亚砷酸钠水溶液180 d后,检测肺组织氧化应激指标,病理学改变及免疫相关基因的表达。结果发现,砷染毒组小鼠肺超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)显著下降,脂质过氧化产物丙二醛含量显著升高。显微镜观察发现砷组小鼠肺组织炎性细胞浸润,肺泡隔增厚,肺泡囊缩小。氧化应激指标及病理学改变呈现剂量依赖性。50 mg/L As组Th1细胞因子IFN-γ的转录水平显著升高,Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)的转录被抑制,IL-4/IFN-γmRNA比值显著降低。研究表明,长期经口摄入砷引发了小鼠肺组织的氧化损伤和组织结构改变,并造成了肺Th1/Th2细胞因子失衡,Th1炎症反应加强。砷引起的肺组织结构损伤及免疫失衡可能与砷诱导的肺氧化应激相关。     

结核分枝杆菌对感染小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体和铁蛋白表达的影响

探讨不同毒力结核分枝杆菌感染对小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)表达的影响及其时相性变化。利用制备的卡介苗(以下简称BCG)和结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株(以下简称H37Rv株)悬液,分别经小鼠尾静脉注射,建立各组小鼠感染模型,各组小鼠感染模型建立成功后,分别于第1、3、5、7、9、11、13、15天,进行各组小鼠肺泡灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取各组小鼠肺泡巨噬细胞。应用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR和Fn的表达。利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达结果显示:H37RV组与BCG组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达均高于空白对照组,在感染第7、9、11天差异最明显,具有统计学意义(P0.05)。利用Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RN组、BCG组、空白对照组三组之间差异有统计学意义(P0.05)。用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RV组与BCG组的小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达量明显减低,并且于第7天时表达量最第,异有统计学意义(P0.05)。结核分枝杆菌感染小鼠,导致小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达增高,而Fn的表达降低。不同毒力的结核杆菌感染后Fn蛋白表达差异并不明显,而不同毒力的结核杆菌感染后TfR蛋白的表达有差异性。     

人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养.发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的.     

Rv3129的构建、表达、纯化以及免疫原性分析

目的 以结核分枝杆菌休眠期相关蛋白Rv3129作为研究对象,构建其重组质粒并进行原核表达,并通过体外人群实验、体内动物实验验证其免疫原性。方法 构建、表达并验证Rv3129蛋白,通过人外周血刺激释放实验、小鼠血清抗体水平检测以及各细胞因子检测实验验证该疫苗的免疫原性。结果 成功构建、表达及纯化rRv3129,可刺激M.tb感染人群外周血能够有效分泌高水平IFN-γ。动物实验中,初免增强策略下的亚单位疫苗Rv3129/DIM能够诱导强烈的Th1型免疫应答,分泌的抗体水平显著高于其他组别。结论 该亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能够在机体内诱导强烈的Th1型免疫反应,对预防成人结核病可能具有重要意义。     

大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养方法的建立

为建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞培养的方法,为后续细胞共培养奠定实验基础。采用通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞的方法,进行形态学观察,并应用流式细胞术检测BMSCs免疫学表型,对其进行鉴定;将获得的第三代BMSCs向脂肪细胞和成骨细胞方向进行诱导分化,诱导21 d后的脂肪细胞应用油红O染色进行鉴定,成骨细胞应用茜素红染色进行鉴定;将获取的骨髓细胞液按照造血系单核干细胞诱导培养法向破骨细胞方向进行诱导分化,于28 d后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色进行鉴定。结果显示,BMSCs体外培养14 d具有独特的细胞免疫学表型,流式细胞术检测,CD29+、CD44+表达量分别为97.92%和89.32%;在脂肪培养基诱导下,油红O染色阳性。在成骨培养基诱导下,茜素红染色阳性;骨髓细胞液在破骨培养基诱导下,抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。由此可知,建立了稳定的大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞诱导分化及破骨细胞诱导分化的培养方法。     

当归诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经元样细胞

研究当归体外定向诱导人脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化的作用.自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.AMSCs用25×10-6L/mL〖JP〗当归注射液预诱导24 h后,用100×10-6L/mL当归注射液不含血清的DMEM/F12进行诱导.光镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.人脂肪组织中能够分离培养出生长旺盛的脂肪间充质干细胞,当归诱导24 h后,部分AMSCs转变为神经元样细胞,出现突起,免疫细胞化学染色NSE呈阳性、GFAP阴性.人脂肪间充质干细胞在体外可被当归诱导分化为神经元样细胞 .