同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR的建立及应用

目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用。方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV。考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109～104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强。应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染。阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%。结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒。     

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立鸽圆环病毒(PiCV)TaqMan探针荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 通过比对NCBI发表的PiCV各分离株序列,选取其polymerase基因保守序列设计引物探针,建立PiCV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性及敏感性进行验证;取浓度为3.48×10⁵和3.48×10⁴copies/μL的质粒标准品,每个浓度做6个平行,重复检测3次,计算组内和组间变异系数,验证方法的重复性和稳定性;用该方法检测采自北京某养殖场的鸽肝、脾、肺、法式囊样本各40份及鸽盲肠样本36份,以验证此方法在实际应用中的检测能力。结果 建立的PiCV荧光定量PCR方法在3.48×10⁷～3.48×10¹ copies/μL范围Ct值与质粒浓度呈线性关系,标准曲线Slope为-3.381,R²值为1,扩增效率为97.61%。可检测到的PiCV最低浓度为34.8 copies/μL,与常规PCR法相比,检测灵敏度高2个数量级;以猪圆环病毒2型、禽腺病毒I型及III型、禽白血病病毒、禽网状...     

小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 建立小鼠巨细胞病毒(Mouse Cytomegalovirus,MCMV)荧光定量PCR方法并对其进行初步应用。方法 选取NCBI发表的MCMV Smith株DNA polymerase基因保守序列设计引物探针,建立MCMV的荧光定量PCR方法,对方法的特异性、敏感性、重复性及稳定性进行验证,并应用该方法检测掺入MCMV的小鼠血液样品及2018年度送检的409份小鼠血液样本。结果 建立的MCMV荧光定量PCR方法标准曲线Slope为-3. 418,R2值为0. 999,扩增效率为96. 137%,可定量检测到的MCMV最低含量为47 copies/μL。以大鼠巨细胞病毒,猴巨细胞病毒,人单纯疱疹病毒,伪狂犬病毒及猫疱疹病毒I型为模板均无扩增曲线,特异性良好。方法组内和组间变异系数分别为0. 39%～0. 68%和0. 48%～1. 01%,重复性和稳定性好。可检测到掺入小鼠血液样品中MCMV病毒的最大稀释度为1∶1000(100. 75 TCID50/0. 1 m L),409份小鼠血液样品经检测均为阴性。结论 建立的小鼠巨细胞病毒荧光定量PCR方法有很好的敏感性、特异性及稳定性,可有效地检测小鼠中MCMV,为实验小鼠MCMV的监测及相关标准的补充完善提供了技术参考。     

猫细小病毒 PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的 建立猫细小病毒 PCR 检测方法,应用于猫临床样本中 FPV 的快速检测。方法 根据已发表的 FPV VP2 基因序列设计合成引物,并以此建立 FPV 的 PCR 检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。 用建立的方法对 33 份猫临床样品进行检测。结果 建立的 FPV PCR 检测方法与猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)、猫冠 状病毒(FeCV)、猫合胞体病毒(FeSFV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为 5lgTCID50 / mL,相应的 DNA 模板浓度为 4. 9 × 102 拷贝/μL;FPV DNA 在 － 30℃冰箱放置 12 个月仍可检测出目的条带。应用 该方法从 33 份猫临床样本中检测出 21 份 FPV 核酸阳性。结论 建立的 FPV PCR 检测方法具有特异、敏感及稳定 的特点,适合于临床 FPV 的感染检测。     

猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中编码猫杯状病毒（FCV）衣壳蛋白ORF2的保守序列, 设计并合成了一对引物和相应的TaqMan探针, 建立了快速检测FCV的荧光定量PCR
方法. 通过对该方法的反应体系和反应条件进行优化, 建立了标准曲线, 给出了特异性、 敏感性和重复性实验, 并对临床24份疑似样品（其中阳性3份、 阴性21份）进行检测.  结果表明: 该方法检测cDNA的线性关系为0.992, 线性范围为2.26×10¹¹~2.26×10¹拷贝/μL; 可检测出样品中的FCV, 其他猫相关病毒检测为阴性; 批内重复性实验变异系数为2.158%, 与病毒分离结果相符.     

仙台病毒荧光定量 PCR 检测方法的建立及初步应用

目的 建立敏感特异的仙台病毒( SeV)荧光定量 PCR 检测方法,并初步应用。 方法 将不同株 SeV 病毒序 列进行比对,选择对保守区域设计合成引物。 人工合成 SeV 基因组 12 181 ~ 12 480 DNA 序列,转入质粒中,作为仙 台病毒质粒标准品,建立 SYBR 染料法荧光定量 PCR 方法,并对样本进行 SeV 测定。 结果 建立了特异性的检测 SeV 的 SYBR 荧光定量 PCR 方法,该方法对 SeV 最低检测限度为 10 copies / μL。 将所建立的实时荧光定量 PCR 方 法用于 40 只 SPF 小鼠和 58 只裸鼹鼠的肺组织样本的检测,检测结果为仙台病毒核酸阴性;检测 4 只成年屏障环 境饲养黄鼠肺组织和 5 只清洁级小鼠肺组织,检测结果为仙台病毒核酸阳性率 100% 。 结论 该研究建立的 SYBR Green 染料法荧光定量 PCR 方法能特异敏感地检测仙台病毒。     

荧光定量RT-PCR检测脑心肌炎病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank中公布的脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus EMCV) 3D基因保守区段设计并合成1对引物, 以提取的EMCV核酸为模板, 分别进行荧光定量RT PCR扩增, 优化反应体系及条件, 建立脑心肌炎病毒荧光定量RT PCR检测方法, 并初步运用于静注人免疫球蛋白(IVIG)纳米膜过滤工艺去除EMCV效果的验证. 结果显示该方法实验内和实验间的精密度均小于5%, 最低检测限为102 copies/ μL; 纳米膜过滤工艺可使样品中的EMCV滴度下降4Logs.     

鹅细小病毒研究进展

对小鹅瘟的病原体鹅细小病毒的遗传物质核酸及其表达产物蛋白质的研究进展进行了综述.     

小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

摘要: 目的建立小鼠微小病毒( MVM) 荧光定量PCR 方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI 上发表的MVM( NC_001510) 基因组序列,设计引物和探针,建立MVM 荧光定量PCR 方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178 份清洁级小鼠粪便DNA 样本进行检测。结果MVM 荧光定量PCR 方法最佳线性范围为109 ～ 104 拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2 值可达0. 99,灵敏度为101 拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1 株和KRV 株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR 方法对178 份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM 荧光定量PCR 方法具有特异、灵敏的特点,为MVM 的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。     

PCR法检测小鼠自身携带的细小病毒

小鼠是 2种细小病毒ＭＰＶ和ＭＶＭ的终宿生。它们均可感染淋巴细胞 ,抑制体内肿瘤形成 ,污染细胞培养。由于细小病毒感染会干扰研究结果 ,因此确定小鼠感染ＭＰＶ还是ＭＶＭ是很重要的。本研究的目的是建立检测排泄物中病毒的ＰＣＲ方法 ,在血清抗体产生之前能够活体检测出ＭＶＭ和ＭＰＶ。排泄物中ＤＮＡ的提取最好用商品化的过柱方法 ,通过增加洗涤步骤帮助去除排泄物中的抑制物。为了提高敏感性 ,比较了4 5个循环扩增排泄物ＰＣＲ和只有 35个循环的组织ＰＣＲ。通过检测 37只来自同一群自然感染ＭＶＭ和ＭＰＶ成年Ｓｅｎｃａｒ小鼠的粪…     

禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒比对结果分析

对6种禽流感病毒通用型荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),PCR检测试剂盒进行比对与科学评价,为实验室采购提供依据。利用禽流感病毒H5、H7、H9亚型标准品,鸡新城疫活疫苗与传染性支气管炎活疫苗对市售的6种品牌(分别记为A、B、C、D、E、F)禽流感病毒通用型荧光定量PCR检测试剂盒灵敏性与特异性进行了比对,并对97份临床样品进行了检测,筛选出禽流感病毒通用型最佳检测试剂盒。结果表明:A厂家试剂盒最低可检出1:100倍稀释的H7亚型标准品浓度,B厂家试剂盒最低可检出1:1倍稀释的H7亚型标准品浓度,C厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,D厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,E厂家试剂盒最低可检出1:1 000倍稀释的H7亚型标准品浓度, F厂家试剂盒最低可检出1:10倍稀释的H7亚型标准品浓度,6种试剂盒特异性均良好。综上,E厂家试剂盒优于其他厂家试剂盒,可以作为动物疫病检测实验室在实施监测任务中的首要选择。     

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析．借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg^2-、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4．5mmol／L,400nmol／L和500nmol／L．同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为10^2个拷贝数的质粒,特异性为100％,CT（Cycle Threshold）值的变异系数CV小于5％．对送检的15份（是否感染ASFV不确定）猪肉样品进行检测,结果全为阴性．试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法．     

实验动物常见支原体荧光定量PCR检测方法建立

目的 建立能对实验动物常见支原体进行检测的荧光定量PCR方法。方法 针对多种大、小鼠易感支原体的16 s rRNA基因中较保守的区域设计1对引物和探针,建立荧光定量PCR方法并检测其特异性、灵敏性及重复性。结果 该方法在模板浓度为5×100～5×106 copies/μL之间呈良好的线性关系(R2=0.9972)且扩增效率为98.11%;特异性强,能够区分检测金黄色葡萄球菌等常见的病原菌;灵敏性高,检测下限为5 copies/μL,比常规PCR的检测灵敏性高100倍;重复性好,对不同浓度模板进行组内和组间重复性试验的变异系数均低于2%。用荧光定量PCR和普通PCR方法对不同来源不同类型的120份临床样品进行检测,结果表明小鼠支原体检测阳性率分别为3.33%(2/60)、1.67%(1/60),细胞样品支原体检测阳性率均为5%(3/60)。结论 本研究建立的荧光定量PCR方法快速、特异强、灵敏性高、重复性好,可用于实验动物常见支原体的快速诊断。     

实时荧光反转录PCR检测呼吸道合胞病毒

目的 建立快速、准确、特异的实时荧光反转录PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV).方法 根据RSV基因序列设计引物和探针并优化实时荧光反转录PCR反应体系,对686例临床标本进行检测,阳性结果测序验证.结果 本实验所建立实时荧光反转录PCR方法可准确、特异地检测RSV;686名呼吸道感染患儿中RSV感染达到16.5%(113/686).结论 本研究建立的RSV实时荧光反转录PCR方法快速、准确,结果可靠,可用于儿童RSV感染的临床诊断.     

烟叶中曲霉菌含量的荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为快速准确地对仓储烟叶中的曲霉菌含量进行测定,通过对几种曲霉菌的ITS区基因序列比对找出曲霉菌属遗传保守序列,以此为靶序列设计特异性引物及Taqman探针,构建烟曲霉基因序列重组质粒为阳性标准品,并绘制标准曲线,建立了烟叶中曲霉菌含量荧光定量PCR检测方法并验证该方法具有较好的特异性、灵敏度及重复性.利用此方法对模拟霉变烟叶进行跟踪检测,结果表明：当烟叶中曲霉菌基因拷贝数在10⁹～10¹¹copies·g^-1之间时,烟叶处于临近霉变的状态;大于10¹¹copies·g^-1时烟叶为霉变状态;小于10⁹copies·g^-1时烟叶则为未霉变状态.该研究以期为仓储烟叶的霉变情况监控提供了一种更为高效灵敏的检测方法.     

人GABRA1实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

根据GenBank上人GABRA1基因的序列,设计并合成特异性的引物及探针,采用TaqMan探针法建立了荧光定量PCR法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线．结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12．07-32．72,相关系数为0．999,扩增效率为96．4%.建立的GABRA1TaqMan探针实时荧光定量方法具有线性范围广、扩增效率高、检测时间短、敏感性高等特点．     

B病毒PCR检测方法的建立

目的建立B病毒核酸的PCR检测方法。方法设计引物,用PCR方法扩增B病毒,并验证其灵敏性和特异性。结果引物P1、P2及P3、P4在以B病毒为模板时有特定大小的目的片段出现,在以其他病毒为模板时无目的片段出现;引物P5、P6以B病毒和人单纯疱疹病毒I型(HSVI)为模板能扩增出382bp的产物,经SacⅡ酶切后,B病毒产生176bp和206bp的两个片段,HSVI无变化。结论通过PCR方法成功的区分开B病毒,并且鉴定区分了B病毒和HSVI。     

犬细小病毒、犬冠状病毒和犬轮状病毒三重PCR方法的建立及初步应用

犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)、犬冠状病毒(Canine coronavirus, CCoV)和犬轮状病毒(Canine rotavirus, CRV)是引起犬腹泻的主要病原.3种病原引发的疾病临床症状相似,难以诊断,因此需要建立可以高效鉴别这3种病原的分子检测方法.通过对引物浓度、退火温度的条件优化,建立了可同时检测CPV、CCoV和CRV 3种病毒的三重PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可特异性扩增CPV VP2基因(253 bp)、CCoV ORF-1b基因(379 bp)和CRV VP6基因(852 bp)的目的片段,未检出其他相关病原;对CPV、CCoV和CRV的最低检测浓度分别为6.44×10^-1 pg/μL、8.72×10^-1 pg/μL和8.35×10^-1 pg/μL,方法的灵敏度高;重复性试验显示该方法具有良好的稳定性.应用建立的三重PCR方法对2019～2020年成都市区采集的135份犬腹泻粪便样本进行了检测,并与单重PCR检测结果相比较.结果显...     

番鸭HSP70的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及其初步应用

旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白70(Heat shock 70, HSP 70)基因的荧光定量PCR检测技术,并以此技术检测番鸭在热应激前后HSP70基因转录表达量的变化情况。由NCBI上HSP 70基因保守序列来设计特异性引物,将试验番鸭的mRNA反转为cDNA,检验其重复性、特异性和灵敏度,利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明：本研究构建的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法所用的引物特异性较好,与1.35×10²～1.35×10⁷ copies/μL的PCR产物之间存在着良好线性关系,方程为y=-1.96 x+18.2,相关系数为-0.983,扩增效率为226.55%;熔解温度T_m值为(84.0±1.0)℃,曲线呈特异性单一峰;该方法的灵敏度为1.35×10² copies/μL。与正常条件相比,热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的HSP 70基因表达水平显著升高(P<0.05)。该研究成功构建了番鸭HSP 70基...     

荧光定量PCR检测HBV DNA及临床意义

目的:了解HBV感染者的常见血清学组合的HBV DNA阳性情况,探讨其临床意义。方法:对260份血清同时用荧光定量PCR与ELISA方法进行检测并进行评价。结果:40例HBsAg(+)/HBeAg(+)/抗-HBc(+)组血清HBV DNA全部阳性,阳性率为100％,含量为10~(7.62±0.69)cps/mL;110例HBsAg(+)/抗-HBe(+)/抗-HBc(+)组血清58例阳性,阳性率为52.7％,含量为10~(4.64±1.31)cps/mL;35例HBsAg(+)/抗-HBe(-)/抗-HBc(+)组血清20例阳性,阳性率为57.1％,含量为10~(4.93±1.42)cps/mL;75例HBsAg(-)组血清中,5例HBV DNA阳性,阳性率为6.7％,含量为10~(3.68±0.46)cps/mL。结论:乙型肝炎患者HBV荧光定量检测是病毒复制最直接可信的指标,动态荧光定量PCR检测HBV DNA,对动态监测乙型肝炎感染的病原学变化及判断有关药物抗-HBV复制是否有效具有一定的临床意义。