山羊PGRMC1基因序列分析及表达特性分析

旨在克隆获得山羊PGRMC1基因序列,并明确该基因的生物学特征,阐明其在山羊各组织及诱导分化不同阶段皮下脂肪细胞中的表达模式.利用RT-PCR技术克隆获得山羊PGRMC1基因序列,通过生物信息学方法分析其生物学特性;通过实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测其在各个组织及不同分化阶段皮下脂肪细胞中的表达水平.结果显示,克隆得到山羊PGRMC1基因序列1 024 bp,其中CDS区585 bp,共编码194个氨基酸,是主要定位于细胞质、细胞核以及线粒体的酸性亲水性不稳定蛋白;分析显示山羊PGRMC1的核苷酸序列与其他物种如绵羊、牛、猪、羊驼、猩猩、人、马、猫、骆驼、狐狸相似程度为88.79%～99.69%不等,说明该基因在不同物种中具有高度保守性;构建进化树显示,山羊PGRMC1与绵羊亲缘关系最近,与马的亲缘关系最远,符合物种进化规律;组织表达谱显示,PGRMC1在山羊心、肝、脾、肺、肾、背最长肌中广泛表达,其中在肝脏中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),其次是在背最长肌和脾脏中的表达水平...     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

牦牛和犏牛睾丸SAMD12基因的克隆测序及其mRNA水平比较

SAMD12是新近发现的SAM结构域家族成员.为进一步探究犏牛雄性不育的分子机制,实验从健康成年牦牛(n=10)和雄性不育犏牛(n=7)睾丸组织中提取总RNA,利用常规基因克隆技术,对牦牛SAMD12基因进行克隆测序,并采用实时荧光定量PCR技术,比较牦牛和犏牛睾丸中SAMD12基因mRNA水平.结果本实验克隆获得了牦牛SAMD12基因的3种变异体,分别命名为v715、v779和v852.v715与普通牛5号变异体完全对应;v779含SAM结构域但与普通牛序列存在一些差异,可能是SAMD12基因的新变异体类型;v852无结构域部分可能不表现活性.定量PCR结果显示:SAMD12基因在牦牛和犏牛睾丸中均有表达,但表达量差异不显著,推测其表达水平与犏牛雄性不育无直接关系.     

藏绵羊KAP3.2基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达的研究

为研究藏绵羊角蛋白相关蛋白(KAP3.2)基因结构与功能,揭示该基因的组织特异性表达规律.以藏绵羊为研究对象,分别提取藏绵羊心、肝、脾、肾及皮肤组织中总RNA,并以此为模板,通过RT-PCR技术对藏绵羊KAP3.2基因的c DNA进行克隆、序列分析;利用Real-time PCR技术进行组织表达研究.结果表明:藏绵羊KAP3.2基因编码区全长297bp,编码98个氨基酸;藏绵羊与普通绵羊、山羊、藏羚羊、草原鼠、家鼠、人的相应核苷酸同源性分别为99%、97%、96%、79%、75%、73%;藏绵羊KAP3.2基因在皮肤中高表达,而在其它组织中相对表达量较低,说明该基因的表达具有组织特异性.     

家猪BMP-2、BMP-3基因克隆及其组织表达探究

本研究以长白猪(Landrace)肺cDNA为模板,扩增获得猪骨形态发生蛋白BMP-2和BMP-3基因的cDNA全长.BMP-2基因cDNA全长为1742bp,编码395个氨基酸的前体蛋白,与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-2基因的氨基酸序列一致性分别94.18%,95.4%,95.2%,90.3%,90.60%;BMP-3基因cDNA全长为1639bp,编码475个氨基酸的前体蛋白,猪与人、牛、绵羊、大鼠、小鼠等的BMP-3氨基酸序列的一致性分别是84.7%、87.7%、82.3%、80.4%、79.5%.采用RT-PCR方法,对BMP-2、3基因在家猪主要组织的表达进行探究.结果显示:BMP-2在所有组织中均有表达;而BMP-3在脑、肺、小肠中表达量较高,其他组织中表达量弱.     

牦牛GSTK1基因序列特征分析及其组织表达谱构建

旨在探讨谷胱甘肽硫转移酶K1(Glutathione S-Transferase Kappa1,GSTK1)基因序列特征.以牦牛为试验对象,通过RT-PCR技术扩增GSTK1基因序列并分析生物信息学,采用RT-qPCR技术构建其在牦牛不同组织中的表达谱.ORF分析显示,牦牛GSTK1基因编码区为618 bp,编码氨基酸为205个.系统发育树分析显示,牦牛与野牦牛(99.68%)、黄牛(99.68%)和野牛(99.40%)之间的同源性最高,与北极熊(87.63%)、野猪(87.25%)和马(87.01%)之间的同源性最低.蛋白预测分析显示,GSTK1蛋白为不稳定的亲水蛋白,存在12个磷酸化位点.高级结构预测分析显示,GSTK1蛋白的主要成分为α-螺旋(50.73%)、无规卷曲(40.00%)和延伸链(9.27%).组织表达分析发现GSTK1在所检测牦牛卵巢、小肠、脾、肝、肾、肌肉、肺和心组织中均有表达,其中表达量最高的组织是肝,表达量最低的组织是脾和心,且与其他组织差异显著(P<0.05).本研究获得了牦牛GSTK1基因的序列特征及组织表达谱,为进一步挖掘牦牛GSTK1基因的功能提...     

牦牛DIO2基因克隆及其在骨骼肌的表达分析

为探索DIO2基因调控牦牛骨骼肌发育及肌纤维类型组成的潜在功能,克隆DIO2基因CDS序列并进行相关的生物信息学分析,以及比较分析其在牦牛骨骼肌的差异表达.结果显示,DIO2基因的CDS全长为789 bp,编码132个氨基酸.序列同源性比对及系统进化树分析发现,牦牛DIO2基因与普通牛的亲缘关系最近,核酸及蛋白序列与普通牛一致;与小鼠的亲缘关系较远,序列同源性仅为86.75%和87.12%,与原鸡的亲缘关系最远,二者的同源性分别为79.17%和76.30%.理化性质预测表明DIO2蛋白为不稳定疏水性蛋白,有跨膜结构域,具有24个磷酸化位点,蛋白结构为无规则卷曲、α-螺旋和延伸链三者交替出现.采用实时荧光定量PCR分析显示,DIO2基因在牦牛的脾、肺等内脏组织表达无显著差异;在背最长肌和半腱肌的表达量显著高于脂肪和肝脏组织(P0.01).此外,DIO2在金川牦牛半腱肌的表达量显著高于麦洼牦牛(P0.05).以上结果为研究DIO2在牦牛骨骼肌的功能提供参考资料.     

绵羊脂联素受体2基因生物信息学分析

采用生物信息学方法对绵羊(兰州大尾羊)AdipoR2基因及其所对应蛋白质进行了分析.结果显示,AdipoR2基因全长1 809 bp,编码386个氨基酸多肽蛋白.核苷酸和氨基酸的同源性与山羊最高,分别为99.1%和99%,非洲爪蟾最低,分别为68.2%和78.5%.兰州大尾羊AdipoR2编码蛋白二级结构中α-螺旋占23.06%,β-片状占27.72%,无规则卷曲占49.22%.ADIPOR2蛋白为跨膜蛋白,N-端位于胞内,C-端位于胞外,由7个跨膜结构域组成.分析表明,绵羊AdipoR2基因由7个外显子和6个内含子组成,核苷酸序列变异以转换为主,转换/颠换比值为2.072.不同物种间绵羊与山羊AdipoR2核苷酸序列间变异最小(0.9%).系统发育分析表明,绵羊与山羊也首先聚为一类,推测绵羊与山羊的分歧时间大约在0.225百万年前.这些结果为进一步分析绵羊脂联素受体2(AdipoR2)基因功能及其所介导的脂联素功能奠定了理论基础.     

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.     

蒙古鮊ob基因的克隆与组织表达特异性的初步研究

根据已知的人和鼠ob基因序列设计引物,通过运用RT-PCR技术首次从蒙古鮊脂肪组织的RNA中扩增获得ob基因片段,并经序列分析证实为ob基因编码区438 bp的序列.不同物种同源性比较表明ob基因序列具有很高的保守性:蒙古鮊与人、猪和鼠的ob基因核苷酸编码序列的同源性分别为82.9%、84.0%和99.1%;蒙古鮊ob基因编码的蛋白leptin氨基酸序列与人、猪和鼠氨基酸同源性分别为80.8%、78.8%和95.9%.用RT-PCR技术分析组织ob基因的表达特异性,结果表明:ob基因在脂肪和肝脏组织中的表达量最大,在心脏、脾脏、肌肉、脑、卵巢中的表达量次之,在肾脏中仅微量表达,而在精巢和肠道组织中则不表达.     

山羊奇异变形杆菌毒力因子zapA基因的克隆及蛋白结构预测

为了研究山羊奇异变形杆菌毒力因子,克隆zapA基因和预测推导的蛋白结构.采用PCR方法,对山羊奇异变形杆菌zapA基因进行扩增、克隆及序列测定;利用生物信息学软件预测推导zapA蛋白的信号肽、跨膜区、二级结构及B细胞抗原表位.结果表明:zapA基因长为1 476bp,编码491个氨基酸,与参考株的核苷酸序列同源性为99.59%,氨基酸同源性为99.59%;zapA蛋白存在信号肽,无跨膜区,B细胞表位可能位于69-71,78-84,136-139,197-199,353-356,371-373和472-474氨基酸区域内或附近.该试验为奇异变形杆菌zapA蛋白的表达及基因工程疫苗的研制提供了理论基础.     

牦牛INHBA基因的克隆及序列分析

根据GenBank检索到的普通牛的INHBA基因序列设计一对特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术对牦牛INHBA cDNA进行克隆测序和序列分析.结果表明:扩增片段1360bp,包含1277bp的编码区,编码426个氨基酸.与普通牛相比,牦牛INHBA基因编码区存在2处碱基转化.牦牛与普通牛、绵羊、人、鼠和猪的核苷酸序列同源性分别为99.84%、97.97%、91.41%、87.79%、91.94%,氨基酸序列同源性分别为99.53%、98.82%、95.77%、93.88%、93.88%.蛋白质结构分析显示,INHBA蛋白不易形成α螺旋和跨膜结构,是相对保守的疏水性蛋白.     

牦牛GRB2基因克隆及其在生殖轴的表达研究

生长因子受体结合蛋白2(GRB2)是一种信号转导分子,通过细胞信号传导参与细胞增殖和分化过程.为了探讨GRB2基因在牦牛繁殖中的调控作用,采集5头成年母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,利用反转录PCR、生物信息学分析方法和RT-qPCR技术进行GRB2基因克隆、蛋白质结构预测及在生殖轴组织表达检测.结果表明,牦牛GRB2基因的CDS全长为654 bp,编码217个氨基酸,与黄牛、绵羊和山羊的同源性高,蛋白质一级结构中天冬氨酸所占比例最高,无跨膜结构和信号肽.二级结构主要包括自由卷曲、延伸链和α螺旋,三级结构的分析结果与二级结构相似.细胞定位分析发现GRB2蛋白主要存在于细胞核和细胞质中.RT-qPCR结果显示GRB2基因在牦牛下丘脑和脑垂体前叶表达量显著高于输卵管、卵巢和子宫(P0.05);GRB2基因在黄牛脑垂体前叶和卵巢表达量显著高于牦牛(P0.05),而在两物种的其余三个组织没有显著差异(P0.05).推测GRB2基因可能影响母牦牛的繁殖能力.     

藏绵羊脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、T-A克隆技术获得了藏绵羊H-FABP基因, 并对克隆序列进行分析. 结果显示, 藏绵羊H-FABP编码基因全长402bp, 编码133个氨基酸. 将藏绵羊H-FABP基因及氨基酸序列分别与Gene Bank中公布的山羊、水牛、家牛、野牦牛、猪、马、狗7种动物进行序列一致率比对, 结果显示, 藏绵羊与所选的7种动物的H-FABP基因序列一致率在90.8%～99.5%之间, H-FABP氨基酸序列一致率在93.2%～100%之间. 其中, 藏绵羊与藏山羊H-FABP基因存在2个位点核苷酸差异:114位碱基位点A→G和第129位碱基位点T→C, 但两个位点的核苷酸差异均为同义密码子, 藏绵羊与山羊H-FABP氨基酸无差异.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.     

中间锦鸡儿CiCesA3的克隆及表达分析

为了研究中间锦鸡儿Caragana intermedia纤维素合酶基因(cellulose synthase,CesA)的结构及表达特性,通过同源克隆及RACE(rapid amplification of cDNA end)技术,获得1条中间锦鸡儿CesA基因的全长cNDA序列.NCBI Blast结果显示该基因与野生大豆Glycine soja基因GsCesA3相似度最高(94%),因此命名为CiCesA3.CiCesA3基因cDNA全长为3 475 bp,其中5'UTR长为175 bp,3'UTR长为76 bp,开放阅读框长度为3 225 bp,编码1 075个氨基酸.CiCesA3蛋白预测分子质量为119.89 ku,第16位到第79位氨基酸为CesA蛋白保守的锌指结构(Cx2Cx12FxACx2CxEx5Gx3Cx2C).CiCesA3蛋白C端有6个跨膜结构域,为亲水性蛋白.qRT-PCR检测不同组织中基因表达量的结果表明CiCesA3在叶中表达量最高.以上结果证明中间锦鸡儿CiCesA3基因与其他植物CesA基因相似,并无变异,为阐明中间锦鸡儿纤维素的合成提供了依据.     

山羊Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

对单胎藏山羊和多胎金堂黑山羊Apaf-3基因cDNA克隆、序列分析及组织表达特性研究.采集5只多胎金堂黑山羊和5只单胎藏山羊在发情期的卵巢、垂体等组织样,进行Apaf-3基因的cDNA克隆、序列分析,并采用定量PCR技术对其mRNA进行组织表达量研究.结果,克隆出山羊Apaf-3基因长度为1731bp编码区全长为1245bp,编码414个氨基酸.Apaf-3基因在两种山羊中序列相同,且在5种组织中的表达均无差异.同源性分析表明凋亡基因Apaf-3在动物的进化中保守性低,与山羊多羔性状的相关性需要进一步研究.