利用根癌农杆菌介导的转化方法改良木霉菌

根癌农杆菌介导的转化系统在丝状真菌的研究中具有重要的意义。通过农杆菌介导,成功实现了丝状真菌绿色木霉菌(Trichoderma viride)遗传转化,转化率约为30～80个转化子／10^5个孢子。PCR检测和几丁质酶分析表明含有编码几丁质酶外源基因(Cli 113)的T-DNA已整合进木霉菌基因组中,而且转化子都能够稳定遗传。农杆菌介导的遗传转化方法具有转化率高、操作简便、遗传稳定等优点,在丝状真菌的遗传转化中具有重要的意义。     

根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系

随着分子生物学研究的深入,植物功能基因组研究以及后续的大规模基因工程都必将依托于高效的植物遗传转化体系,因此植物遗传转化体系越来越成为分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础．农杆菌介导转化法被认为是最具发展潜力的植物遗传转化方法．本文介绍了根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系．     

含Cry1Ab/Ac基因的白僵菌工程菌的构建

以来源于苏云金芽孢杆菌的Bt-Cry1Ab/Ac基因为目的基因,以潮霉素Hyg为抗性标记基因,以绿色荧光蛋白基因GFP为报告基因的真菌表达载体,采用农杆菌介导真菌遗传转化(ATMT)法,将Cry1Ab/Ac基因插入白僵菌基因组中,先后用潮霉素B抗性筛选、荧光检测、真菌基因组PCR分子检测法、Bt-Cry1Ab/Ac基因检测试纸条多种方法进行转基因工程菌株鉴定,结果证实了目的基因成功插入白僵菌基因组,为白僵菌杀虫活性的深入研究奠定了基础.     

农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用

农杆菌介导的真菌遗传转化具有效率高,成本低,操作方便和重复性好等特点,大大提高了真菌的转化效率,增加了转化子的稳定性,为研究真菌基因功能,分离克隆相关基因提供了新的途径。     

提高根癌农杆菌介导黑曲霉转化效率的研究

为提高根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导黑曲霉(Aspergillus niger)转化(ATMT)效率,本文对影响转化效率的分生孢子与农杆菌的比例、转化媒介、诱导溶氧、诱导时间、诱导时乙酰丁香酮(AS)浓度这5个因素进行单因素实验,最终确定提高其转化效率的最优条件为:根癌农杆菌诱导过程在400,μmol/L乙酰丁香酮终浓度条件下,100,m L三角瓶中28,℃、100,r/min振荡培养5,h,分生孢子与根癌农杆菌的比例为1﹕100,在硝酸纤维膜媒介上24,℃共培养48,h.在此优化条件下,黑曲霉的转化效率达到35个/107分生孢子.相比于优化前,转化效率提升了78%,,并且整合至黑曲霉基因组的外源潮霉素B抗性基因在转接15代以后仍能稳定遗传.     

影响农杆菌介导的辣椒基因转化因素的研究

试验设置农杆菌类型、辣椒基因型、外植体、vir基因活化培养基、方法5个因素，研究了利用根癌农杆菌介导法辣椒遗传转化的效果。以获得Km抗性芽外植体频率为指标，发现农杆菌菌株类型和辣椒基因型对转化效率都有较大影响，直接影响着转化效率。采用预培养2d的子叶外植体，用农杆菌侵染5～7min，可获得最高的转化效率。     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

农杆菌介导的八氢番茄红素合酶基因转入人参愈伤组织影响因素

以PSY为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对人参愈伤组织进行遗传转化,从菌液浓度、侵染胞龄、侵染时间、共培养时间四方面优化了遗传转化体系。经PCR分析鉴定初步证明,外源基因PSY已整合到人参的基因组中。     

根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

花生子叶节外植体遗传转化体系的建立

目的： 为了建立花生的高效遗传转化体系。方法：利用花生子叶节高效再生体系,以农杆菌介导法,用含有表达质粒pBOG3VP7的根癌农杆菌进行外源基因转化,优化花生的遗传转化体系。结果：通过对影响农杆菌介导的花生遗传转化的诸多因素进行的优化,试验表明：侵染菌液添加100祄ol/L AS,结合负压处理,农杆菌侵染10min,共培养3d,延后选择2w。对抗性植株进行PCR和PCR－Southern检测,11株中有6株PCR反应呈阳性,其中有3株Southern杂交有特异性目标带出现。结论：结果表明,外源基因已经整合到了花生基因组上。     

一种高效的柑橘绿霉菌基因敲除体系的构建

研究目的：提高柑橘绿霉菌基因敲除效率。创新要点：低效的基因敲除与丝状真菌非同源末端链接（NHEJ）的DNA双链断裂修复途径有关。为提高柑橘绿霉病菌基因敲除效率,本研究利用农杆菌介导的转化体系,获得NHEJ途径中关键因子Ku80的缺失突变体（△pdku80）。研究方法：与野生型菌株相比,以△PdKu80作为出发菌株,提高柑橘绿霉病菌PdbrlA和PdmpkA的基因敲除效率（见表1）。重要结论：△PdKu80的营养生长、产孢和致病性与野生型菌株基本一致。△PdKu80作为出发菌株,能显著提高柑橘绿霉菌的敲除效率。     

Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of the phytopathogenic fungus Penicillium digitatum

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation （ATMT） system was assessed for conducting insertional mutagenesis in Penicillium digitatum, a major fungal pathogen infecting post-harvest citrus fruits. A transformation efficiency of up to 60 transformants per 106 conidia was achieved by this system. The integration of the hph gene into the fungal genome was verified by polymerase chain reaction （PCR） amplification and sequencing. These transformants tested were also shown to be mitotically stable. Southern blot analysis of 14 randomly selected transformants showed that the hph gene was randomly integrated as single copy into the fungal genome of P. digitatum. Thus, we conclude that ATMT of P. digitatum could be used as an alternatively practical genetic tool for conducting insertional mutagenesis in P. digitatum to study functional genomics.     

三种水稻转基因技术体系的比较研究

研究比较了外源基因导入水稻的三种技术体系,即ＰＥＧ介导法,基因枪法和农杆菌介导法．综合考虑转化频率、转化周期、转化难度和转化成本等因素,认为在水稻转基因研究中,最经济、有效和易行的技术体系是农杆菌介导法．     

草莓的遗传转化研究进展

农杆菌介导的叶盘转化法是草莓遗传转化的主要方法．采用该方法，已成功将抗病毒、抗真菌、抗虫、抗逆境、控制果实成熟软化等方面的多种外源目的基因转入草莓．文章概述了外源目的基因转入草莓的研究进展以及基因型、农杆菌菌株、侵染时间和菌液浓度、共培养时间、酚类物质等对草莓遗传转化的影响，并对今后草莓遗传转化研究的重点提出了建议．     

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of CryⅠA(b) gene to Trichoderma harzianum

In this study, Cry ⅠA(b) gene was successfully transferred into the biocontrol fungus Trichoderma harzianum with an efficiency of 60-180 transformants per 10^6 spores by using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Putative transformants were analyzed to test the presence of Cry ⅠA(b) gene by Southern blot. Most transformants contained a single T-DNA copy. RT-PCR analysis showed that the Cry ⅠA(b) gene was transcribed. Antifungal activities and insecticidal activities of the transformants were examined. There was no obvious difference in antifungal activities between the transformants and their wild strains. The modified mortalities of the transformants T1 and T2 were 69.57% and 91.30%, respectively. The tranformation system mediated by A. tumefaciens proved to be a powerful tool for the filamentous fungi transformation and functional genomic study with its high transformation frequency, simplicity of T-DNA integration, and genetic stability of transformants.     

白菜类作物转基因技术研究进展

白菜类作物是芸薹属中重要的栽培亚种群,也是重要的蔬菜之一。建立高效可重复的植株再生和遗传转化体系是利用基因工程进行遗传改良所必需的。本文从高频率植株再生体系的建立,ＤＮＡ直接转移,不依赖于植物细胞或组织培养的农杆菌介导转移,建立在细胞或组织培养基础上的农杆菌介导的转化,转化株后代的遗传行为等方面论述了白菜类作物转基因技术的最新研究进展,并提出了存在的问题和进一步的研究方向。     

转APX基因烟草抗旱能力研究

用毛白杨中克隆得到的抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因,构建植物表达载体pBI121-APX,将pBI121-APX载体用农杆菌介导法转化烟草,成功得到转基因烟.PCR、PCR-Southern的结果表明,APX基因已经成功的整合到转基因烟草基因组中.干旱实验结果表明,与对照相比较,转基因烟草表现出较强的抗旱性.     

玻璃粉创伤棉花茎尖分生组织遗传转化的研究

评估玻璃粉创伤棉胚茎尖分生组织的转化效率及初步建立其遗传转化体系。高速涡旋的玻璃粉创伤棉胚茎尖分生组织,利用农杆菌介导法将报告基因gusA导入棉花,GUS组织化学染色后观察棉胚转化情况,探讨不同转化条件对转化的影响。结果表明：0。2g玻璃粉创伤棉胚,茎尖分生组织的较多细胞被转化,成活12株幼苗,较适宜。涡旋90S转化条件下获得2株GUS阳性苗,涡旋时间越长茎尖分生组织创伤程度越严重,能提高转化效率,但成苗量降低。此外．转化效率受菌液浓度及菌种的影响,OD600为0．8的农杆菌LBA4404菌液侵染棉胚,较多细胞能表达gusA的活性且表达水平较高,而被农杆菌GV3101侵染后的棉胚染色效果较差。