重组类人Ⅰ型胶原蛋白分离与纯化

目的 研究重组类人Ⅰ型胶原蛋白基因工程的下游工艺。方法工程菌株Escherichia coli BL213．1在Bioengineering L1 523型12．8L自控发酵罐中经24h发酵，细胞干重达到77．3g/L，表达量为菌体蛋白量的29．4％。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后，依次经DEAE52，Sephadex G100柱层析分离纯化。结果最终产物纯度达到98％，回收率为80．5％。结论纯化的类人Ⅰ型胶原蛋白经SDS-PAGE电泳测定为电泳纯，分子质量为90ku，N端序列为NH2-H-D-P-V-V-L-Q-R-R-D-W-E-N-P-G，与基因序列设计一致。     

重组类人胶原蛋白Ⅱ膜的生物相容性

目的探讨用戊二醛交联得到的重组类人胶原蛋白Ⅱ(recombinant human-like collagenⅡ,RHLCⅡ)膜的生物相容性。方法用浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L的戊二醛分别交联RHLCⅡ得到两组RHLCⅡ膜(0.005 mol/L组和0.01 mol/L组);把成纤维细胞接种到两组RHLCⅡ膜上,用倒置显微镜和扫描电子显微镜观察细胞贴附情况;用MTT法分析成纤维细胞在两组RHLCⅡ膜上的生长和增殖情况;通过细胞毒性实验评价两组RHLCⅡ膜的细胞毒性。结果当成纤维细胞培养到6 h时,均能贴附于两组RHLCⅡ膜上;培养到96 h时,两组RHLCⅡ膜上的成纤维细胞均融合成片并形成多层细胞;经MTT法分析,细胞接种后96 h,成纤维细胞在两组RHLCⅡ膜上均能实现增殖;0.01 mol/L组比0.005 mol/L组细胞毒性要大,但两组在各时间段,毒性评定均在0~1级,细胞毒性实验合格。结论戊二醛浓度为0.005 mol/L和0.01 mol/L的RHLCⅡ膜具有良好的生物相容性。     

类人胶原蛋白基因工程茵高密度发酵过程控制

目的优化基因工程菌Escherichia coli BL21生产人源型胶原蛋白的高密度发酵工艺。方法建立一套以溶解氧浓度和比生长速率为中心的控制策略，采用溶氧反馈或pH反馈调节补料速度。结果OD600可达150，胶原蛋白的表达量为9g／L。结论20％～30％饱和度的溶解氧和0．1-0．2h^-1的比生长速率有利于细胞生长和产物表达，其与降低乙酸等有害代谢副产物的积累密切相关。     

固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白

目的 研究利用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白的洗脱方法 ,以优化分离纯化的条件.方法 将吸附了重组类人胶原蛋白的层析柱采用降低pH,增大离子强度和增大NH4Cl浓度3种方法 进行洗脱.结果 采用增大NH4Cl浓度的方法 进行洗脱所得的洗脱峰面积最大,洗脱体积最小,纯化后重组类人胶原蛋白的纯度达97.9%,回收率为68.6%,纯化倍数为2.78.结论 采用固相金属亲和层析纯化重组类人胶原蛋白是可行的,可有效地对重组类人胶原蛋白进行纯化.     

类人胶原蛋白生物相容性实验研究

目的 为扩大类人胶原蛋白的应用，评定和比较猪胶原蛋白、类人胶原蛋白和明胶在动物体内的生物相容性。方法分别用胶原材料和明胶进行以下生物学测试：急性毒性试验、溶血试验、热原试验、皮肤刺激试验。根据标准对试验数据进行分析和评估。结果类人胶原蛋白的急性毒性试验、溶血试验、热原试验、皮肤刺激试验均为阴性。结论材料生物学测试结果显示类人胶原蛋白较其他两种材料的生物相容性更高，是理想的医用生物材料。     

类人胶原蛋白基因工程菌高密度发酵过程控制

目的优化基因工程菌Escherichia coli BL 21生产人源型胶原蛋白的高密度发酵工艺。方法建立一套以溶解氧浓度和比生长速率为中心的控制策略,采用溶氧反馈或pH反馈调节补料速度。结果 OD600可达150,胶原蛋白的表达量为9g／L。结论 20％-30％饱和度的溶解氧和0．1- 0．2 h-1的比生长速率有利于细胞生长和产物表达,其与降低乙酸等有害代谢副产物的积累密切相关。     

重组大肠杆菌分批-补料培养生产类人胶原蛋白的过程控制

目的优化重组大肠杆菌高密度发酵的调控工艺。方法通过考察比生长速率、3种控氧方式以及诱导强度对细胞和类人胶原蛋白产量的影响,确定最佳的发酵工艺。结果比生长速率显著影响类人胶原蛋白的产量,且最适比生长速率为0.15～0.20h-1;在提高罐压的条件下,细胞和类人胶原蛋白的浓度均显著高于其他两种控氧方式,充入富氧空气的细胞和类人胶原蛋白的浓度均最低;诱导强度对细胞生长和蛋白质表达的影响非常大,当细胞浓度达47±2g/L(DCW)时,开始升温至42℃进行诱导,最佳条件为42℃保温2～3h,然后降温至39℃继续培养5～6h。结论通过优化重组大肠杆菌分批补料培养生产类人胶原蛋白的工艺,使得细胞和类人胶原蛋白浓度分别达68.94g/L(DCW)和13.02g/L。     

重组类人胶原蛋白Ⅱ仿生人工骨材料的制备

目的 采用重组类人胶原蛋白Ⅱ(recombinant human-like collagen Ⅱ,RHLCⅡ)制备仿生人工骨复合材料,并对复合材料进行研究.方法 采用相分离一冷冻干燥法制备RHLCⅡ复合材料;利用扫描电镜、透射电镜、X射线衍射仪、红外光谱仪和万能电子材料实验机对材料的理化性能进行表征;选择急性毒性实验、溶血实验、皮内实验和热原实验对材料的生物相容性进行评价.结果 RHLCⅡ复合材料在晶相组成、化学组成和晶体尺寸方面均类似于天然骨,抗压强度和弹性模量介于致密骨和牙本质之间;复合材料的急性毒性实验、溶血实验、皮内实验和热原实验均为阴性.结论 RHLCⅡ复合材料具有良好的理化性质和生物相容性,有望成为培养自体成骨细胞的理想支架材料.     

离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白

通过层析实验，比较了几种阴离子交换剂在不同温度、pH值、离子强度、进样流速、进样浓度下对人血清白蛋白的吸队与脱附性能，研究了它们对人血清白蛋白和卵清蛋白的分离能力，并考察了桩层析过程中吸附载体对重组人血清白蛋白和杂蛋白的分离选择性，实验结果表明：版号为DEAE Sepharose FF的载体不仅对重组人血清白蛋白具有良好的分离度，而且有较高的回收率。     

类人胶原蛋白基因工程菌诱导后比生长速率优化

目的优化类人胶原蛋白基因工程菌高温诱导后的比生长速率。方法通过分析不同比生长速率下发酵液中菌体浓度、类人胶原蛋白浓度、细胞得率系数(YX/S)、产物得率系数(YP/S)的变化,确定诱导后的最佳比生长速率。结果当比生长速率为0.04～0.05h-1,细胞浓度和类人胶原蛋白的浓度分别可达69.5g/L(DCW)和13.8g/L。结论诱导后的比生长速率对细胞生长、类人胶原蛋白的合成均产生显著性影响。     

类人胶原蛋白-钙螯合物的制备及相关研究

为了制备安全性高且补钙性能优良的补钙制剂,以水体系合成法制备类人胶原蛋白（human-like collagen, HLC）-钙螯合物,探究体系pH值和原料配位比对钙螯合率的影响,并采用紫外-可见吸收光谱和傅立叶红外光谱对制备的类人胶原蛋白-钙螯合物进行分析.确定的最佳工艺条件为：体系pH值5．0,且HLC与CaCl2的质量比10∶1.光谱结果显示：类人胶原蛋白分子和Ca2＋之间存在相互作用,且制备的钙螯合物是一种异于HLC的新化合物;羰基和亚氨基参与HLC分子与Ca2＋间的螯合反应,且钙螯合物保持类人胶原蛋白分子原有的α-螺旋结构.研究结果为类人胶原蛋白-钙螯合物的大规模制备和进一步应用开发提供了理论依据和研究基础.     

响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基

目的 借助于MINITAB统计学软件,采用Plackett-Burman设计和响应面优化法对基因工程菌Escherichia coli BL21发酵生产类人胶原蛋白的原始培养基进行优化研究.方法 首先利用 Plackett-Burman设计筛选出对类人胶原蛋白产量影响显著的3个因素,即葡萄糖甘油1:4混合碳源、酵母粉和硫酸铵.在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域,找到后续实验的中心点.再利用Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,确定主要影响因素的最佳水平.结果 优化后的3种主要影响成分为葡萄糖甘油1:4,混合碳源12.24 g/L,硫酸铵7.12 g/L,酵母粉5.53g/L.结论 方程拟合良好,优化后的培养基发酵产量经摇瓶和发酵罐验证,产量分别为5.91g/L和6.12g/L,较优化前分别提高了306%和296%.     

类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响

目的研究类人胶原蛋白HLC（Human—like Collagen）对于细胞生长、细胞凋亡、细胞生长周期及细胞形态的影响。方法用体外细胞培养法，选用BHK-21细胞系为实验对象，进行MTT检测、LDH测定、流式细胞分析、形态学观察及统计学分析。结果MTT检测表明0．2，0．3g／LHLC对于细胞生长有显著的促进作用；HLC对于细胞培养液中LDH浓度无显著性影响；经0．1，0．2，0．3g／LHLC作用后的细胞凋亡百分数变化不大，进一步作周期分析，也无显著影响；形态学观察表明0．3g／LHLC对于细胞形态有加长作用。结论HLC可能通过影响细胞膜、增强细胞贴壁生长而促进细胞生长。     

类人胶原蛋白工程菌质粒稳定性研究

目的研究基因重组大肠杆菌补料分批发酵生产类人胶原蛋白过程中质粒稳定性。方法通过平板复制法,观察质粒稳定性在不同生长周期、卡那霉素浓度和不同比生长速率中的变化。结果质粒稳定性受生长周期、卡那霉素和比生长速率的影响。在μ为0.15、卡那霉素浓度为0.005g/L的情况下,工程菌生产效率最理想。结论通过控制发酵过程中的质粒稳定性可以有效地提高菌体产量和目标蛋白产量。     

类人胶原蛋白-微孔淀粉的制备及生物学评价

文中以微孔淀粉为主体,研究一种新型复合止血材料的制备及生物学评价。此复合材料由一定比例的α-淀粉酶与糖化酶复合后处理淀粉以形成微孔结构,然后复合类人胶原蛋白,再以戊二醛为交联剂进行交联;用SD大鼠作肝脏出血模型进行止血效果对比试验。通过正交试验确定微孔淀粉最优制备工艺条件如下:α-淀粉酶:糖化酶=1∶3,T/℃=50,t/h=20,pH=4.8;用0.2%(V/V)戊二醛乙醇溶液交联的类人胶原蛋白-微孔淀粉止血材料,在相同的止血时间下,该复合材料平均吸水率为3 580%,对照组(分别是微孔淀粉和类人胶原蛋白海绵)的平均吸水率为3 160%和3 280%。而在SD大鼠肝脏实验中,复合材料t/s=94±13,而外购的止血剂t/s=121±15。类人胶原蛋白-微孔淀粉复合材料止血的止血原理从3个方面展开:①微孔淀粉吸收水分并将血液中的有形物质聚集到表面;②加速内源性凝血因子的激活使其形成血栓;③在类人胶原蛋白的牵引下,淀粉颗粒聚成团大幅度增加了比表面积,使止血效果更优秀;对照组止血机理只包含了该复合材料的前两个方面。结果显示,复合材料的止血效果要优于普通微孔淀粉制成的止血剂,证明该复合止血材料具有良好的止血性能。     

类人胶原蛋白表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

基于人胶原蛋白胶原域序列特征,设计合成了一段类人胶原蛋白基因单体gel.采用同向串联方式,构建了含6个单体的类人胶原蛋白表达载体pPIC9KG6,并经DNA测序鉴定.将pPIC9KG6电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)经G418筛选得到多拷贝转化子,通过甲醇诱导表达类人胶原蛋白,SDS-PAGE检测表明:初步表达的类人胶原蛋白为胞外产物,其表观分子量为112 ku.     

“条件水溶重组胶原蛋白多聚体放大实验’’项目通过省教育厅验收

2006年7月14日，陕西省教育厅主持召开了“条件水溶重组胶原蛋白多聚体放大实验（03JC02）”项目评审验收会。评审验收委员会认真审阅了课题组的技术资料，认为该项目技术路线合理，聚合条件温和，易控制。分离纯化工艺易于工业化放大操作，一致同意该研究成果通过验收。     

EDTA反相纸层析分离有色金属离子的研究

通过反相纸层析研究了ＥＤＴＡ对有色金属离子的萃取能力，并绘制了Ｒｆ图谱同时用ＥＤＴＡ反相纸层析成功地分析了有色金属离子。     

大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白分析方法及在肝纤维化研究中的应用

用破碎、酶解、盐析三步法提纯大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白,并用ECL-Western blot测定正常及纤维化肝组织中Ⅰ型胶原蛋白的含量,来建立一种有效、简便的大鼠肝组织Ⅰ型胶原蛋白的提取、纯化及鉴定的方法,研究抗纤维化药物的作用机制.结果发现,该法提取Ⅰ型胶原蛋白的时间周期短,得率高,纯度达到PAGE纯的水平,并且检测灵敏度高.大鼠轻度肝纤维化时,即可发现Ⅰ型胶原蛋白含量明显增多,且可被抗纤维化药物逆转.结果表明该法具有简便、灵敏和无放射性污染等优点,为研究肝纤维化机制及筛选抗纤维化药物提供了有价值的方法.     

基因重组酵母工程菌优化表达人源胶原蛋白

通过响应曲面法(RSM)优化巴氏毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6表达高亲水性重组人源胶原蛋白的摇瓶培养条件。采用Box-Behnken设计(BBD)考察初始诱导pH值、温度和甲醇添加量三个主要影响因子对重组人源胶原蛋白表达量的影响,利用DX7Trial软件设计实验方案,根据该方案设置不同培养条件进行实验并测定相关参数。响应面分析确定的最优因素水平组合为:初始诱导pH值为5.0,诱导温度为28℃,甲醇添加量为2.2%/24 h。通过响应面法优化发酵的内在因素水平,找出最佳条件,为利用其指导在发酵罐中进行高密度发酵生产人源胶原蛋白奠定基础。