南昌链霉菌与放线菌噬菌体ΦC31相互关系的研究

经点滴法和平板法检测,放线菌噬菌体ΦC31及大部分衍生噬菌体能感染南昌链霉菌,但这些噬菌体的DNA却不能南昌链霉菌。通过比较来自不同宿主的KC515噬菌体悬液对为铅青链霉菌和南昌链霉菌的侵染效率,发现南昌链霉菌对ΦC31及衍生噬菌体具有很强的限制性。Southern杂交实验表明,ΦC31衍生噬菌体KC301（C^ attP^ ）可以整合到南昌链霉菌NS－32－26的染色体上形成溶源,其溶源菌自发释放KC301,但热激诱导后并没有提高释放频率。通过脉冲电泳技术和Southern杂交的方法定位了KC301在南昌链霉菌NS－32－26染色体上形成溶源的附着位点（attB)。这些结果均有利于利用以ΦC31为基础的载体对南昌链霉菌进行分子生物学的研究。     

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件,将Ｎｏｄａｌ基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些拾报告基因的质粒转化Ｆ９细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶海性。Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ｂｐ,其中含有一个位于－３３ｂｐ处的ＴＡＴＡｂｏｘ,它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性,但其活性不强。     

具有抗农作物病原真菌活性的链霉菌IIR21菌株中attB位点的分析

以7种农作物病原真菌为指示菌,采用菌块法和杯碟法测定了链霉菌IIR21菌株次级代谢产物的抗农作物病原真菌活性,用PCR方法扩增了链霉菌IIR21菌株的att B的序列,并进行了生物信息学分析.结果表明:链霉菌IIR21菌株对稻瘟病菌、立枯丝核病菌具有较强的抑菌活性;链霉菌IIR21菌株的att B位点序列长269 bp,它与Streptomyces natalensis的att B位点核心区域的序列的相似度最高,达到92%,具有发生交换的核心区域5'-TT.含有ΦC31att P位点的整合型质粒p SET152可通过att P位点与链霉菌IIR21菌株的染色体上的att B位点发生位点特异性重组.     

酵母编码区及非编码区的统计分析

以酵母全基因组中第一类的2505个编码序列和相对应的非编码序列为统计样本,给出了酵母编码起始区和编码终止区以及非编码区碱基的分布特征,我们发现,真核生物的Yeast和原核生物的E.coli同样,四种碱基在编码区呈3周期分布,非编码区没有3周期特性,在起始密码子前－3位点上碱基A、C、T明显偏置,与Marilyn Kozak的结果相比较看出,这一伴点与进化无关。＋4位点碱基T、G的使用和有椎生物不同,有可能与进化有关。     

具有抗稻瘟病菌活性的ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立

从湖北省神农架地区土壤中筛选出一株具有抗稻瘟病菌活性的ⅡW1菌株,采用菌块法测定了ⅡW1菌株对稻瘟病菌的抑菌活性,通过形态结构、生理生化和16S rDNA基因序列同源性比对对ⅡW1菌株进行鉴定,同时对链霉菌ⅡW1菌株attB序列进行克隆,并建立接合转移的方法.结果表明:ⅡW1菌株属假灰色链霉菌,链霉菌ⅡW1菌株对稻瘟病NO-1菌株和168菌株的抑菌圈直径分别为29.7 mm和27.4 mm;链霉菌ⅡW1菌株attB序列具有位点特异性重组所必须的核心位点5′-TT-3′.含ΦC31attP位点的整合型质粒pSET152通过两亲接合转移导入链霉菌ⅡW1菌株.     

中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子克隆与分析

为了探明中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子表达调控机制,利用DNA步移法克隆了中国明对虾卵黄蛋白原基因启动子及其上游调控序列,总长1 100bp.分析表明,在基因转录起始位点上游-30～-24bp处有1个TATA box,未发现有CAAT box和GC box.同时,在上游调控区还存在有多个可能影响启动子转录活性的顺式作用元件,如NF-κB,YY1和SP1等转录因子结合位点.这些结果为深入研究中国明对虾卵黄蛋白积累及卵子发生过程奠定了基础.     

具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2菌株的分离鉴定及其att B位点的分析

以稻瘟病菌NO-1为指示菌,从神农架地区土壤中筛选得到一株微生物,命名为ⅠT2.通过形态、生理生化研究和16S r DNA基因序列同源性比对,初步鉴定为链霉菌属.不同发酵条件对链霉菌ⅠT2菌株发酵液抑菌活性的影响研究表明,链霉菌ⅠT2菌株较适合的发酵条件为:发酵温度26.5～30℃,发酵转速150 r/min,发酵时间48 h.利用PCR扩增获得ⅠT2菌株的att B位点序列,链霉菌ⅠT2菌株的att B位点序列长277 bp,与S. griseus M095的att B位点核心区域的序列的相似度为97%,具有发生交换的核心区域5'-TT.含有ΦC31att P位点的整合型质粒p SET152可通过att P位点与链霉菌ⅠT2菌株通过其染色体上的att B位点发生位点特异性重组.     

猪生长激素受体(GHR)基因启动子的 克隆及功能分析

本研究以猪作为研究模型, 对GHR基因启动子区开展了克隆 、转录因子结合位点分析和启动子活性鉴定.结果表明: 家猪GHR基因或由两个启动子(GHR P1和GHR P2)控制.GHR P1的部分核苷酸序列与牛、羊对应核苷酸序列具有较高的同源性, 但功能分析显示其启动子活性较低.针对GHR P2的实验结果表明其具有典型的GHR组成型启动子特征, 荧光素酶报告实验表明其具有启动子活性, 因此我们推测本次克隆获得的GHR P2是猪GHR的组成型启动子.     

猪hnRNPK基因启动子的克隆及序列分析

首次克隆了猪hnRNPK基因启动子序列,并进一步对该序列进行了分析.结果显示:该基因启动子约1 kb,与已报道的人的相应序列相似度为78.9%,具有相同的"TCTCGCGAGA"核心启动子序列和转录起始位点.利用在线软件分析发现,猪hnRNPK基因启动子不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,存在两处CpG岛,具有SP1、UCE.2、GCF、EARLY-SEQ1、TTR_inverted_repeat、NGFI-C、EARLY-SEQ1等多种转录因子潜在结合位点,并且具有8种基序结构.     

猪hnRNPK基因启动子的克隆及序列分析

首次克隆了猪hnRNPK基因启动子序列,并进一步对该序列进行了分析.结果显示:该基因启动子约1 kb,与已报道的人的相应序列相似度为78.9%,具有相同的"TCTCGCGAGA"核心启动子序列和转录起始位点.利用在线软件分析发现,猪hnRNPK基因启动子不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,存在两处CpG岛,具有SP1、UCE.2、GCF、EARLY-SEQ1、TTR_inverted_repeat、NGFI-C、EARLY-SEQ1等多种转录因子潜在结合位点,并且具有8种基序结构.     

Pinb基因启动子生物信息学分析及载体构建

运用生物信息学预测并分析小麦硬度基因Pinb的启动子,利用无缝克隆构建胚乳特异表达载体.采用生物信息学软件预测Pinb基因5’端上游调控区3056bp序列进行启动子预测与分析,克隆启动子,利用无缝克隆技术构建Pinb基因的胚乳特异表达的重组质粒,重组质粒经测序鉴定构建正确.Pinb基因5’上游-3060bp至-4bp区域内存在启动子活性,在-2419bp至-500bp间启动子活性分值均在0.8以上,其中-550bp至-500bp区启动子片段分值最高,达到0.99.在-2862bp处和-362bp处各有一个转录起始位点.在-544bp处有一个CAAT盒信号,在-541bp处有一个TATA盒信号.在-2362bp至-2256bp、-1704bp至-1559bp和-537bp至-361bp处各有一个CpG岛.取最有可能的757bp(-803bp至-47bp)启动子片段构建重组质粒(LBLV232),质粒经酶切和测序验证正确.最终,成功构建Pinb基因启动子报告基因表达载体,为系统研究该基因启动子活性提供前期基础.     

大鼠Neuritin基因启动子区克隆、鉴定及生物信息学分析

目的本研究旨在了解大鼠Neuritin基因启动子区特征,为明确神经受损后的再生中Neuritin基因在体内转录水平的调控提供理论依据。利用比较基因组学获取较为可靠的置信序列并设计上、下游引物克隆大鼠Neuritin基因5'调控区片段。方法采用生物信息学方法分析扩增片段序列特征,并采用多款转录因子预测软件预测大鼠Neuritin基因启动子主要调控区的转录因子结合位点。结果研究结果表明成功克隆出3447 bp大鼠Neuritin 5'调控区序列,大鼠Neuritin 5'调控区序列与小鼠同源率为91. 1%。生物信息学方法分析发现距大鼠Neuritin基因CDS区上游740～1012 bp位置处有一个Cp G岛,224 bp处有一个TATA-Box,初步推测大鼠Neuritin基因CDS区上游1100 bp为主要核心启动子区域。利用生物信息学软件预测主要调控区域含有AP-1,AP-2,AP-4和CREB等八个重要的转录因子结合位点。结论本研究大鼠Neuritin基因启动子的鉴定和相关转录因子结合位点的发现为进一步研究大鼠Neuritin基因的表达调控奠定了数据基础。     

人NLK上游启动子区的克隆与鉴定

初步鉴定并分析NLK上游启动子,为研究其转录调控打下基础。对NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的序列分别进行生物信息学分析,以PCR技术扩增以上序列并测序。将PCR所得到的NLK上游片段进一步克隆到PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒PGL-3basic-luc。通过荧光素酶报告基因实验检测上述启动子的活性。成功构建了包含NLK基因上游启动子序列的荧光报告系统,经荧光素酶报告基因实验证明该重组质粒体具有转录活性。构建的NLK基因上游启动子报告基因载体为进一步研究NLK基因的转录调控机制奠定了基础。     

山羊Agouti基因启动子活性区域探究

对前期拼接获得的12 847 bp山羊Agouti基因序列(EF587236和JN651404)进行启动子活性区域预测,确定候选启动子区为6 450~7 100 bp,得到一个长度为2 537 bp的DNA片段,在该区域发现一个典型转录因子结合位点TATA框,并预测到HSF,SYR,GATA-1,Nkx-2,ADR1等多个转录因子结合位点;山羊基因组序列(登录号:AJPT01136617.1)中有两段序列与牛的预测启动子promoter A和promoter B同源性较高,据此设计引物扩增目的片段,同时构建12个荧光素酶报告基因质粒,瞬时转染人皮肤黑素瘤细胞A375和293T细胞检测目的片段是否具有Agouti基因启动子活性。结果表明,所构建的目的片段质粒与阴性对照相比无显著差异,说明所获得的目的片段不具有启动子活性。     

一个GAP启动子的分析及点突变体构建

甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAP)作为常见的持家基因在微生物中普遍表达,因而其启动子(PGAP)被认为是一个强的组成型启动子;首先,预测并克隆了双叉双歧杆菌的GAP启动子,并利用葡萄糖醛酸苷酶基因为报告基因,分析了PGAP在大肠杆菌和双歧杆菌中驱动表达的强度;不同碳源的发酵实验表明:PGAP在葡萄糖培养基中强度最高,而3种底物类似物对PGAP强度的影响各不相同;对PGAP预测的-10区进行了系列点突变,具有更接近sigma 70启动子共有序列的突变体p MGAP3表现出更高的驱动强度;最后,通过对代表性双歧杆菌PGAP序列的比对,表明在一些核心区域,如可能的TATA盒、转录起始位点、核糖体结合位点高度保守。     

瑞氏木霉木聚糖酶Ⅱ启动子功能区缺失分析的初探

木聚糖酶Ⅱ(Xylanase Ⅱ)是瑞氏木霉中两种主要的内切木聚糖酶之一．序列分析显示其1．1kh的启动子区含有多种丝状真菌转录因子结合位点，可受多种激活因子、抑制因子、增强子的转录调控．以编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的E．coli uidA基因为报告基因，分别与木聚糖酶Ⅱ启动子及功能区(-312～-1080)缺失启动子融合，构建报告质粒pXIIPU与pXIIP△EXU，引入瑞氏木霉蛋白酶缺陷株Trichoderma reesei RutC30U4．先后对转化子进行发酵实验，测定GUS活性。结果显示功能区-312～-1080缺失后的启动子活性是原启动子活性的19％．结果表明在缺失的木聚糖酶Ⅱ启动子-312～-1080区仍存在调节转录活性的顺式作用元件，值得进一步研究．     

乌鳢（Channa argus）干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子的克隆与特征分析

应用抑制差减杂交、末端快速扩增和基因步移技术,克隆并鉴定了乌鳢干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子序列.Viperin cDNA全长1474nt,包含1059nt的开放阅读框,编码352个氨基酸.除N末端70个氨基酸外,Viperin蛋白氨基酸序列在鱼类和哺乳类具有高度的保守性.ISG15 cDNA全长758nt,包含468nt的开放阅读框,编码155个氨基酸,含有两个泛素样(UBL)结构域,C末端具有保守的UB偶联结构(LRGG).Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件(ISRE)和γ-干扰素激活序列(GAS).ISRE是干扰素刺激基因启动子区的重要特征,并与干扰素调控因子(IRF)1和IRF2的识别序列(IRF-E)部分重复;GAS参与介导II型干扰素激活基因的诱导转录.Viperin启动子区还包含保守的NF-κB结合位点,这是保守的NF-κB结合位点以一致的序列模式(GGGRNNYYCC)出现在鱼类干扰素刺激基因启动子区的首次报道.此外,Viperin和ISG15启动子尚存在TATA,CAAT,Sp1等转录因子结合位点.乌鳢ISG15基因5′非编码区含有单一的内含子,而Viperin基因5′非编码区未发现内含子.Viperin和ISG15mRNA主要表达在头肾、后肾、脾脏和鳃,肝脏中也有少量表达.体内干扰素诱导剂polyI:C刺激后,Viperin和ISG15基因在肝脏的表达水平明显增加.     

基于位置关联权重矩阵的大肠杆菌启动子预测

对实验证实的683条大肠杆菌sigma70启动子的序列进行保守性计算分析,获得四个保守的区域:-10区域是启动子最保守的功能元件,-35区域、转录起始位点附近及启动子上游UP单元.从保守区中选取M 6(1)值较大的10个保守位点的六联体频数作为参数、引入伪计数构建位置权重矩阵,利用位置关联打分函数对683条sigma70启动子进行预测.负集分别从编码区和非编码区选取700条序列进行算法检验,获得很好的结果,敏感性分别为91%和90%.进而利用位置关联打分函数对大肠杆菌整条序列进行搜索,获得1567条预测序列.这些序列可能是实验未测定的启动子序列.     

不同荧光蛋白基因标记利迪链霉菌

 利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）A01 是一株分离自北京郊区对植物病原真菌具有广谱抑制作用的放线菌,在植物真菌病害防治中具有良好的应用前景。为了检测红霉素启动子在利迪链霉菌A01 中的活性,为后期对菌株A01 进行遗传改造提供技术支持,同时对生防菌A01 进行遗传标记以研究和阐明其在生态环境中的生物学行为规律,本实验采用两亲本接合的方法,将增强绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（RFP）基因片段克隆到携带红霉素启动子（ermE^*）的链霉菌表达载体pIB139 中,成功构建了以egfp 和rfp 为报告基因的重组载体pIB139-EGFP 和pIB139-RFP,并转化利迪链霉菌A01,突变株在荧光显微镜下观察到较强的绿色荧光和红色荧光,同时PCR 鉴定结果正确。这表明重组载体pIB139-EGFP 和pIB139-RFP 成功转入菌株A01,并且ermE^*启动子成功启动egfp 和rfp 基因表达。     

转座子Tn917的DNA序列计算机分析

通过计算机分析转座子Ｔｎ９１７的全序列，详细阐述了其物理图谱、结构功能及其转录调节机制．Ｔｎ９１７的５个ＯＲＦｓ排列在同一条ＤＮＡ链上，且阅读方向都从左至右．ＯＲＦ１－３起始点的左侧翼排列有启动子序列和Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ序列．ＯＲＦ５（编码转座酶）和ＯＲＦ４（编码拆分酶）的转录方向是一致的，翻译也紧密偶联在一起．在ＯＲＦ３和ＯＲＦ４之间存在１个ｒｅｓ位点，与Ｔｎ３中的ｒｅｓ位点基本同源．翻译衰减的功能与ｒＲＮＡ甲基化酶（由ＯＲＦ２编码的、ｅｒｍ基因的产物）诱导有关，在这个结构基因的左侧翼有２００ｂｐ的前导区域编码一个具调控功能的３６个氨基酸组成的多肽（由ＯＲＦ１编码）．