转基因油菜籽多重PCR-DNA芯片联用检测方法的研究

根据转基因油菜中所转入的外源基因，选择CaMV35S启动子、FMV35S，PAT基因和目的基因mCP4-EP-SPS，BAR，MS8，RF3以及内源PEP基因设计特异性引物，采用多重PCR法对待测样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIG-dUTP标记杂交探针，并制备基因芯片，在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，并对检测的灵敏度进行测试，结果表明，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0．1％，由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因，提高了检测的准确性和效率．     

Reconstruction of enzymatic activity from split genes encoding glyphosate-tolerant EPSPS protein of Psedomonas fluorescens G2 strain by intein mediated protein complementation

N-phosphonomethylglycine, commonly referred to as glyphosate, is a broad-spectrum, non-selective herbicide used for the control of weeds in glyphosate-to- lerant crops. Glyphosate inhibits the 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), a key en…     

Mutant acetolactate synthase （ALS） gene as a selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation of soybean

Soybean is one of the crops most difficult to be manipulated in vitro. Although several soybean marker genes, all the selectable markers used were from bacteria origin. To find suitable selectable marker gene from plant origin for soybean transformation, a mutant acetolactate synthase （ALS） gene from Arabidopsis thaliana was tested for Agrobacterium-mediated soybean embryo axis transformation with the herbicide Arsenal as the selective agent. Transgenic soybean plants were obtained after the herbicide se- lection and the To transgenic lines showed resistance to the herbicide at a concentration of 100 g/ha. ALS enzyme assay of To transgenic line also showed higher activity compared to the wild type control plant. PCR analysis of the T1 transgenic lines confirmed the integration and segregation of the transgene. Taken together, our results showed that the mutant ALS gene is a suitable selectable marker for soybean transformation.     

慢性粒细胞性白血病不同病期bcr-abl基因 P53基因突变研究

探讨 bcr- abl融合基因、P53 基因对 CML不同病期演变的作用 .采取 CML2 6例不同分期共30份标本 ,应用逆转录—聚合酶链反应 (RT- PCR)技术检测 bcr- abl融合基因 ,应用多聚酶变 .结果显示 2 4例 CML慢性期中 2 2例 bcr- abl基因 ( ) ,6例急变期中 5例 bcr- abl基因 ( ) ;CML慢性期未发现 P53 基因突变 (0 / 2 4 ) ,急变期发现 2例突变 (2 / 6 ) .2例 P53 基因突变中 ,1例 bcr- abl基因( ) ,1例 bcr- abl基因 (- ) .由此可得 P53 基因突变在 CML慢性期少见 ;P53 基因突变对部分 CML急变有一定作用     

长叶车前花叶病毒上海株(RMVsh)外壳蛋白基因的克隆、序列分析及原核表达

长叶车前花叶病毒上海分离株（RMVsh)是从上海郊区的青菜（Brassica chinensis)上分离鉴定的，以提纯的病毒为材料，SDS－酚法纯化的基因组RNA作为模板，通过RT－PCR方法克服了该病毒的外壳蛋白基因（CP），DNA序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长474个碱基，编码157个氨基酸，将CP基因插入原核表达载体pBAD/His-C中，转化E.coli Top10后，诱导表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈－特异性的蛋白条带，Western blot检测表明，表达产物与RMVsh抗血清呈阳性反应，RMVsh CP基因的核苷酸序列及氨基酸序列与烟草花叶病毒属中其他能侵染十字花科作物的成员相比，同源率分别为83．5％－98．9％和87．9％－99．4％，并讨论了RMVsh的分类地位为烟草花叶病毒属侵染十字花科植物2个亚组中的第一亚组的代表。     

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ宁夏分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

用酶联免疫吸附法对宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种进行卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ)的测定,检测率为37.1%,与田间自然发病率调查结果基本一致.设计GLRaVⅢ外壳蛋白(CP)基因序列引物对,进行RT-PCR扩增,获得1.1 kb的特异片段.其中,CP基因长942 bp,推导的编码蛋白含有313个氨基酸.通过对GLRaVⅢCP基因同源性比较,结果表明,GLRaVⅢ宁夏分离物的CP基因与四川分离物SL-10 CP基因的亲缘关系最近,核苷酸和所编码的氨基酸序列同源性分别为98.8%和98.1%;与巴西分离物PET-4和智利分离物C1-817 CP基因亲缘关系较远,核苷酸序列同源性低于95.0%,所编码的氨基酸序列同源性低于97.0%,认为GLRaVⅢ株系间的CP基因存在差异.     

香石竹斑驳病毒（CarMVsh）外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的,以提纯的病毒为材料,ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板,ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ,ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ,转化为Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９。阳笥克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析,证明带有全长ＣＰ基因。     

5S及16S rDNA序列PCR扩增用于环境军团菌检测

军团菌病（Ｌｅｇｉｏｎｎａｉｒｅｓ’ｄｉｓｅａｓｅ）是一种严重的空气传播疾病,在世界各地都常有报道,是由军团菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌａ）引起,该菌迄今已鉴定出了４４个种,其中１８种具致病性,最常见的导致严重病症的种有嗜肺军团菌（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ...     

农杆菌介导的大豆反义fad2-1基因转化烟草研究

以烟草无菌苗叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导法,将大豆反义油酸脱饱和酶基因导入烟草中,经梯度卡那霉素筛选,获得可在含75mg/L卡那霉素选择生根培养基上再生的抗性植株75株,其中67株抗卡那霉素植株的PCR分析扩增出目的片段;RT-PCR分析表明该基因在烟草中表达.结果表明大豆反义油酸脱饱和酶基因在烟草基因组中整合和表达.这为大豆反义油酸脱饱和酶基因转入大豆和表达奠定基础,也为烟草基因工程育种提供了依据.     

转基因大豆和玉米加工产品的双重精确定量PCR检测方法

在很多国家,转基因生物(GMOs)及其衍生产品必须标有精确的转基因含量.最近研究中,实时定量PCR技术广泛应用于转基因成分的检测.然而,转基因生物的实时定量PCR方法的精确度仍然是一个难以解决的问题,尤其是对于高温处理过的样品.为了更好地准确定量高温处理样品中转基因的含量,对普通的实时定量PCR体系做了一些改进,包括重新设计内源基因和外源基因的引物,使得扩增较短并且大小接近的目标DNA片段,同时引物的GC含量和溶解温度也都相近.此外,采用热处理加工模型(HTPM)的方法,制备了含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品,并验证了改进后的实时定量PCR系统.实验结果表明:使用改进后的实时定量PCR体系测定热处理过的样品,发现其中的转基因含量的定量偏差明显降低.同时使用改进的双重实时定量PCR进一步验证转基因大豆的加工食品,结果也显示,转基因含量的定量结果更准确.这些结果表明:改进的双重实时定量PCR将适用于热加工产品的定量检测.     

大麦黄矮病毒（BYDV）外壳蛋白基因在小麦原生质体中的稳定转化

实验采用ＰＥＧ介导法转化小麦，用ＧＵＳ基因作为标志，用荧光法测定Ａｃｔｌ－ＧＵＳ、Ｅｍｕ－ＧＵＳ、３５Ｓ－ＧＵＳ三种质粒转化小麦细胞后的瞬间表达强度，以比较Ａｃｔｌ、Ｅｍｕ、３５Ｓ三种启动子在小表中的表达强度．结果表明，Ａｃｔｌ和Ｅｍｕ的强度大致相等，均比３５Ｓ强．采用Ｅｍｕ为启动子带ＢＹＤＶＣＰ基因的质粒和经改造过的Ａｃｔ１为启动子带有抗潮霉素选择标记基因的质粒共转化小麦“济南１７７”的原生质体．转化６ｄ后，用潮霉素进行筛选，最后得到两块抗潮霉素的愈伤组织，转化后４个月，经ＰＣＲ检测，证明ＣＰ基因已整合进一块愈伤组织的细胞基因组中．     

采用基因芯片技术筛查农作物转基因背景

采用基因芯片技术对转基因作物中常见的启动子、终止子和选择标记基因等多个外源基因进行检测，以建立一套快速、准确的转基因作物筛查鉴定技术．通过对大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测，并由常规PCR技术进行验证，证实基因芯片的检测结果准确可靠，并提高了检测效率，因此，可用于农作物转基因背景的鉴定．     

Stable expression of Arabidopsis vacuolar Na+/H+ antiporter gene AtNHX1, and salt tolerance in transgenic soybean for over six generations

The Arabidopsis vacuolar Na+/H+ antiporter gene,AtNHX1,was introduced into soybean by Agrobacterium-mediated transformation.Four independent kanamycin resistant lines were obtained.The result of PCR,Southern blotting and Northern blotting analyses demonstrated that the AtNHX1 gene was successfully inserted into the soybean genome and stably expressed in these kanamycin resistant lines.The stability of AtNHX1 expression and salt resistance were evaluated in the soybean transformants for over 6 generations.Tw...     

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.     

大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到puCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%.确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.     

细茎大豆（G.gracilis）rbcS基因结构与分子进化分析

从细茎大豆的嫩叶中提取总ＤＮＡ，用ＰＣＲ方法扩增得到包含完整编码区的ｒｂｃＳ基因并将其克隆到ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ载体中。完成全基因１０８９个核苷酸测序后，运用ＰＣＧＥＮＥ进行顺序编辑和同源比较，并应用ＭＥＧＡ１．０２１软件中的Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ方面画出Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基仓的系统进化树。     

我国市售食用菌中金黄色葡萄球菌污染调查、耐药性及其肠毒素基因检测

调查了2011—2016年我国市售食用菌中金黄色葡萄球菌的污染情况,并对分离到的相关菌株进行了肠毒素基因的检测和耐药性分析。收集全国39个城市699份市售食用菌,利用定性和定量检测方法,检出金黄色葡萄球菌阳性样品33份,平均污染率4.72%,污染水平9.75MPN/g。24种抗生素的药敏结果显示,分离株耐药情况严重,对利奈唑胺、利福平敏感,对氨苄西林等22种抗生素都产生不同程度的耐药。7株分离株经表型和分子鉴定确定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。运用聚合酶链式反应法对分离的39株金黄色葡萄球菌进行了18种肠毒素基因检测,约60%分离株携带4~6种肠毒素基因,携带率最高的肠毒素基因是sei,其次是sem、seg、seq、sec、seb、sen。本研究反映了我国市售食用菌金黄色葡萄球菌污染的潜在风险,相关分离株具毒性潜力,且耐药性严重,应引起重视。     

转基因马铃薯植株中外源基因PCR扩增和拷贝数测定

本文报道一种简便、快速、可靠，同时又适合大量转基因植株中外源基因测定的ＰＣＲ检测技术，同时改进了转基因植物中总ＤＮＡ提取方法，并且用窄缝转移杂交测定了转基因植株中外源基因拷贝数。