人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

构建的FIt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的:构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,FIt3L)胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达.方法:依据FIt3L基因序列设计引物,以RT-PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆FIt3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定.结果:克隆到FIt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的FIt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21(ED3)中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的FIt3L胞外域蛋白的相对分子质量(Mr)为19 000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应.结论:成功克隆FIt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.     

构建的Flt3L胞外域原核表达载体在大肠杆菌中的表达

目的：构建含组氨酸标签的FMS样酪氨酸激酶3配体（Fms—like tyrosine kinase 3 ligand,Fh3L）胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法：依据Fh3L基因序列设计引物,以RT—PCR的方法从小鼠脾脏总RNA中克隆Fh3L基因并构建其胞外域原核表达载体,测序鉴定后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达,用免疫印迹鉴定。结果：克隆到Flt3L编码区全长序列,经DNA测序证明与已报道的序列相同;构建羧基端带有His6标签的Flt3L胞外域蛋白的原核表达载体,转化大肠杆菌后SDS-PAGE分析显示在BL21（ED3）中获得较高表达;免疫印迹分析表明IPTG诱导后表达的Flt3L胞外域蛋白的相对分子质量（Mr）为19000,与理论值相符,此蛋白与抗His6标签的抗体发生特异性反应。结论：成功克隆Flt3L基因,构建其胞外域蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达。     

人源性14-3-3σ真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人源性14-3-3σ真核表达载体pCMV-Myc-SFN,并观察其在真核细胞中的表达。方法：通过反转录-聚合酶链反应从HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）中获得编码14-3-3σ的cDNA,定向克隆至真核表达载体pCMV-Myc中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内14-3-3σ的表达。结果：构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,将其转染HeLa细胞48h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内14-3-3σ的表达显著增高。结论：成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,为研究14-3-3σ在上皮细胞源性肿瘤中的作用奠定了基础。     

小鼠脂多糖应答蛋白mlrpS的载体构建及融合蛋白表达

为构建小鼠mlrpS-cDNA基因原核、真核表达载体,大肠杆菌表达其融合蛋白。采用反转录-聚合酶链反应从经脂多糖刺激的鼠NIH3T3细胞cDNA中,扩增出编码mlrpS的cDNA。用限制性内切酶KpnⅠand XhoⅠ消化后,插入原核表达载体pTAT中,经酶切鉴定与测序证实后,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。异丙基β—D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产生融合蛋白。经KpnⅠ和XhoⅠ酶切回收mlrpS-cDNA,插入pcDNA3．1载体中;pcDNA3．1-mlrpS再经KpnⅠ和ApaⅠ酶切后,插入到pEGFP—c1载体上,构建pEGFP-mlrpS融合的真核表达载体。构建mlrpS表达载体经测序证实,与GenBank登录的序列完全一致;双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入载体pEGFP及pTAT;SDS—PAGE证实融合蛋白表达成功。说明：成功地构建了mlrpS原核、真核表达载体,成功正确表达了6His／mlrpS融合蛋白。     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。     

人胰岛素原DNA疫苗的构建与鉴定

构建1型糖尿病关键自身抗原胰岛素原（Proinsulin）的DNA疫苗,并在体外对其表达产物进行鉴定。从人胰腺cDNA库用半巢式PCR扩增出编码Proinsulin的cDNA,克隆入载体PGEM－T中,再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组载体pcDNA3.1( )／Proinsulin,测序后在真核细胞COS－7中进行体外短暂表达,Western印迹法对其表达产物进行鉴定。结果克隆的人Proinsulin基因,测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同,仅在第63位氨基酸（C肽区）有一CAG（Glu)→CGG（Arg）的突变,Western免疫印迹法证实DNA疫苗在COS－7细胞中有效地获得了表达。结果说明运用基因克隆方法构建的Proinsulin DNA疫苗,在真核细胞内能有效地表达Proinsulin重组抗原。该疫苗的构建成功,为1型糖尿病的免疫干预提供了实验基础。     

MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

DLL1-ICD基因真核表达载体的构建及转染鉴定

通过克隆DLL1-ICD(Delta-like1细胞内区域)的cDNA及测序鉴定,构建pEGFP-C1-DLL-ICD真核表达载体并进行细胞转染,为研究Notch信号通路与Neuritin的关系奠定基础。首先根据小鼠全长DLL1 cDNA序列,设计DLL-ICD PCR引物,以小鼠胎脑cDNA文库为模板,利用PCR技术扩增DLL1-ICD cDNA。将扩增出的基因片段克隆至pEGFP-C1载体,进行DNA序列测定。并进一步将测序正确的pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体转染HEK293细胞。结果显示:成功克隆了DLL1-ICD的cDNA片段,测序结果与基因文库中的DLL1-ICD序列一致,并在转染真核细胞后获得了较好地表达。表明pEGFP-C1-DLL1-ICD真核表达载体构建成功,并在293细胞中成功表达了DLL1-ICD-EGFP融合蛋白。研究结果为进一步探讨Notch信号通路与神经系统疾病的分子机制奠定基础。     

Ubiquitin真核表达载体构建及在293T细胞中的表达

为构建泛素分子pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体,实现其在293T细胞中表达。采用人工合成ubiquitin基因序列并加入c-Myc标签序列及EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的方法,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中。重组表达质粒经PCR和测序鉴定正确后,脂质体法转染入293T细胞。Western blot和间接免疫荧光法分析重组质粒在细胞中的蛋白表达及定位情况。菌落PCR及测序等分析结果显示:成功构建了pcDNA3.1-Myc-ubiquitin真核表达载体。免疫荧光和Western-Blot结果显示:Myc-ubiquitin重组表达质粒在293T细胞中获得高效表达且蛋白定位于胞浆。由此可知,成功构建pcDNA3.1-Myc-ubiquitin融合表达载体并在293T细胞中高效表达,为课题组进一步探讨与泛素化修饰相关的neuritin的作用机制及功能奠定基础。     

人Delta-like4ext-26-217蛋白原核表达载体的构建及表达

构建人Delta-like4ext-26-217原核表达载体并表达。采用PCR方法扩增hDll4ext-26-217多核苷酸序列,克隆入pMD18T载体。测序正确后,将其亚克隆入pET32a( )原核表达载体,获得pET32a( )-hDll4ext-26-217载体。以该载体转化E.coli菌株BL21,IPTG诱导其表达。采用SDS-PAGE、Western Blot方法鉴定目的蛋白的表达。结果表明,采用SDS-PAGE,Western Blot等方法均可检测到目的蛋白TRX/hDll4ext -26-217,分子量约42.2 KD,主要以包涵体形式大量存在。以上结果为Detla-like4功能的进一步研究奠定了基础。     

广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)克隆及原核表达

目的通过RT-PCR扩增获得广西巴马小型猪Follistatin的cDNA全序列,经克隆测序分析其cDNA序列结构,进而构建pET-Fo原核表达质粒,使用IPTG诱导表达获得其融合蛋白,为将来进一步研究Follistatin对广西巴马小型猪肌肉生长和繁殖性能的影响奠定基础。方法从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA,并以其为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),在合成的特异性引物引导下,扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)cDNA的全序列,长度为1 035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时,将目的基因插入到原核表达载体pET 32a 多克隆位点中,构建了Follistatin的原核表达载体,并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。结论实验已成功地表达了Follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。     

HLA-A*0207重链胞外区原核表达载体的构建及表达

目的：克隆HLA-A*0207(A2)重链基因，构建在羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的A2重链胞外区原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2^ 供白细胞中克隆A2基因并进行DNA测序，并以PCR方法构建在羧基端融合BSP的A2重链胞外区表达载体，在大肠杆菌B121(ED3)中进行表达。结果：从31名HLA-A2^ 供白细胞中克隆到的基因经DNA测序显示，只有从供2得到的基因是HLA-A*0207。将编码该基因编码重链胞外区1-275的序列和编码BSP的序列融合，构建融合蛋白表达载体，并以测序验证。融合蛋白在B121(ED3)中获得高效表达，产物相对分子质量为35000，约占菌体总蛋白的30％，主要存在于包涵体中，对包涵体进行洗涤后得到纯度为80％的重组蛋白。结论：成功克隆HLA-A*0207基因，构建了其胞外区和BSP融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达。     

绿色荧光蛋白标记的NTE活性域表达载体的构建及表达 

利用含有特定限制性内切酶识别位点的引物，通过聚合酶链式反应扩增出人神经病靶标酯酶活性域的编码序列，经T载体克隆测序正确后，双酶切回收特异片段定向插入到增强型绿色荧光表达载体pEGFPN3中，通过酶切反应鉴定，构建了绿色荧光蛋白标记的神经病靶标酯酶活性域的融合表达载体pNESTEGFP。采用脂质体转染的方法将其转染到人神经瘤母瘤细胞SHSY5Y中，用荧光显微镜观察发现神经病靶标酯酶活性域分布于细胞质中，而且没有导致内质网膜的聚集，表明表达载体成功构建和表达。     

绿色荧光蛋白标记的NTE活性域表达载体的构建及表达

利用含有特定限制性内切酶识别位点的引物,通过聚合酶链式反应扩增出人神经病靶标酯酶活性域的编码序列,经T载体克隆测序正确后,双酶切回收特异片段定向插入到增强型绿色荧光表达载体pEGFP-N3中,通过酶切反应鉴定,构建了绿色荧光蛋白标记的神经病靶标酯酶活性域的融合表达载体pNEST-EGFP.采用脂质体转染的方法将其转染到人神经瘤母瘤细胞SH-SY5Y中,用荧光显微镜观察发现神经病靶标酯酶活性域分布于细胞质中,而且没有导致内质网膜的聚集,表明表达载体成功构建和表达.     

人Rab26基因的克隆和表达

以完整EST为参考序列设计引物,以人的胎脑cDNA为模板,用PCR方法筛选获得Rab26基因全长序列,并亚克隆到载体pGEM-T,真核表达载体pEGFP-N1和原核表达载体pET．32a（＋）中,RT-PCR显示该基因在不同组织的肿瘤细胞株中表达量有明显的差异．把Rab26基因转染入HeLa细胞中,通过与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达,显示Rab26定位于胞内膜性细胞器上．在大肠杆菌表达系统获得Rab26基因的高表达．这些结果为进一步研究Rab26基因在细胞内吞和运输功能等方面打下了基础．     

Expression of PHGPx in mammalian cells and its antiviral effect against coxsackievirus group B

To express human phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) in eukaryotic cells and to study its antiviral effect against Coxsackievirus B3m (CVB3m) in vitro, PHGPx cDNA was amplified from a human testis library using specific primers and cloned into expression vector pcDNA3. I/His. Expression of PHGPx was performed in COS-1 cells. The antiviral effect was studied by the treatment of HeLa cells with the recombinant PHGPx. Results showed that the activity of PHGPx expressed in COS-1 cells was 5-fold higher than that in control group, and it inhibited the cytopathic effect on HeLa cells caused by CVB3m. It can be concluded that recombinant PHGPx expressed in COS-1 cells has antiviral effect against CVB3m in vitro.