缓慢成孔型磷酸钙复合材料的性能研究

目的制备并检测CPC—PLGA复合物,为骨组织工程研究提供新的支架材料．方法制备CPC—PLGA复合物,筛选最佳配比并检测其性能;将人骨髓间充质干细胞种植于CPC—PLGA复合物上并体外培养,然后进行扫描电镜观察．结果CPC-30％vol％PLGA力学性能最好,抗压强度40．5MPa,弹性模量13．8Gpa;模拟体液下降解6周材料形成100～300μm相互连通孔隙;骨髓间充质干细胞在支架材料表面生长良好,并通过降解产生的孔洞内材料深部长人．结论CPC—PLGA复合支架材料具有优良特性,适于骨组织工程支架．     

BMSCs与PLGA支架构建组织工程化骨软骨复合组织

目的:探讨同种异体骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养后种植到孔径和孔隙率不同且复合不同胶原和生长因子的PLGA支架上再种植到大鼠肌袋内构建组织工程化骨软骨复合组织的可行性。方法:制作复合BMP-2和Ι型胶原PLGA支架与复合bFGF、TGF-β1和Ⅱ型胶原PLGA支架后把两者用生物蛋白胶粘合形成复合支架,把体外培养扩增的BMSCs种植到复合支架上,植入实验组A组、对照组B组、空白组C组SD大鼠肌袋内,于术后4、8、12周取材,分别行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化、ALP染色、扫描电镜、透视电镜观察。结果:实验组大体标本成骨区呈白色类骨样组织,质硬,成软骨区呈乳白色类软骨样组织,质较硬,两区融合;扫描电镜观察可见成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞,透视电镜尚可见细胞浆内有大量的线粒体和内质网,并见大量胶原分泌,与对照组、空白组有明显区别,组织学评分表明A组较B、C两组差异具有统计学意义(P0.05)。结论:BMSCs体外分离扩增后种植到孔径和孔隙率不同且复合不同胶原和生长因子的PLGA支架上再植入动物肌袋可构建骨软骨复合组织。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的研究

目的：探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（ＭＳＣs）向胰岛β样细胞分化。方法：在无菌条件下从正常成人骨髓中分离间充质干细胞,体外培养传3代后用表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、β-巯基乙醇和高糖培养基诱导MSCs向胰岛β样细胞分化。观察MSCs在诱导前后的形态变化;用胰岛素免疫细胞化学染色检测胰岛素的表达;用双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞。结果：未经诱导的MSCs在培养体系中呈贴壁生长,长梭形,经诱导分化后,细胞逐渐变圆,并聚集成团;胰岛素免疫细胞化学表明细胞团内的细胞呈胰岛素染色强阳性反应：双硫腙染色阳性。结论：人骨髓间充质干细胞可在体外被定向诱导分化为胰岛β样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶

目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞.方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs 表达酪氨酸羟化酶.在镜下,观察MSCs 在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达.结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应.结论: SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞.     

兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞牛松质骨体外相容性研究

探讨脱细胞牛松质骨（Acellular Bovince Cancellous Bone，ABcB）生物衍生材料与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的生物相容性，为组织工程方法修复骨缺损提供依据。将兔骨髓间充质干细胞与ABCB复合并体外培养，然后进行形态学、细胞增殖、蛋白质含量测定。骨髓间充质干细胞能够贴附在ABCB孔隙内生长，细胞生长及蛋白合成功能不受ABCB的影响。ABCB生物相容性良好，可作为组织工程的支架材料应用于骨缺损的修复；BMSCs可以作为骨组织工程种子细胞。     

胶原修饰快速成形PLGA/TCP人工骨支架体外生物相容性研究

探讨经Ⅰ型胶原修饰的快速成型(RP)聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP)支架的生物相容性,为进一步体内实验提供研究基础.以经Ⅰ型胶原修饰改性的PLGA/TCP支架作为实验组,未经胶原修饰的原始支架作为对照组,检测两组支架材料的亲水性.BMSCs接种两组支架,分别测定细胞黏附率、细胞增殖率.扫描电镜(SEM)观察细胞黏附形态,以检验支架材料的细胞相容性.结果表明胶原改性支架具有较高的亲水性,实验组细胞黏附率在接种4、8和12 h者,明显优于对照组(P<0.05).实验组在培养2、4、6和8 d的细胞增殖率也明显高于对照组(P<0.05).扫描电镜可见骨髓基质细胞在实验组支架上的增殖数量多于对照组.说明Ⅰ型胶原改性的PLGA/TCP支架具有良好的细胞生物相容性,可作为骨组织工程支架应用于骨缺损的修复研究.     

人骨髓间充质干细胞体外扩增和向神经细胞定向诱导分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞,在体外不仅可以分化为间充质类细胞,而且可以分化为非间充质类细胞.研究了人骨髓间充质干细胞的体外分离、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件.从骨髓中分离MSC,用MesenCult培养基进行纯化和扩增培养.每扩增一代,细胞数量增加约2～3倍,在体外扩增12代后扩增约4.6×10 4 倍;诱导不同扩增代数的MSC向神经细胞分化,诱导后的细胞平均有80%以上呈现典型的神经元样表型.免疫组化法检测发现,神经元样细胞强表达神经丝蛋白和神经元特异性烯醇化酶,组织化学法检测观察到神经元特有结构尼氏体,表明MSC在体外具有向神经细胞分化的潜能.     

脐带源间充质干细胞的生物学性状及其成脂肪细胞诱导分化

以健康产妇脐带为材料分离脐带间充质干细胞,体外培养扩增传代,做细胞形态观察,计数细胞并绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪测定细胞周期以及免疫表型,测定细胞定向诱导分化成脂肪细胞的能力.发现人脐带源间充质干细胞能在体外培养扩增,可定向诱导分化为脂肪细胞并且具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物学形态和抗原表型.成功建立了脐带源间充质干细胞系,可以作为干细胞研究和应用的新的材料来源.     

胎肝间充质干细胞治疗实验性糖尿病小鼠的研究

目的:研究胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化和治疗1型糖尿病的可行性.方法: 用贴壁筛选法从正常C57BL/6j胎鼠(孕11.5～15.5 d)肝脏中分离出胎肝间充质干细胞,用高浓度葡萄糖、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和尼克酰胺体外诱导胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化;制作1型糖尿病小鼠模型,并将诱导后的细胞移植到1型糖尿病小鼠肾被膜下,连续6周观察血糖变化;用组织学分析移植细胞体内的发育.结果:胎肝间充质干细胞来源的胰岛β样细胞移植到糖尿病小鼠肾被膜下后,具有一定的降低血糖的作用,经过6周以后,接近正常水平;取出移植物,小鼠高血糖重新出现,并很快死亡;移植物作免疫组织化学染色,可以观察到肾被膜下区含有大量胰岛素阳性细胞.结论:胎肝间充质干细胞有望成为1型糖尿病胰岛移植的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞三维培养--构建工程组织

骨髓间充质干细胞因其可获得性、可扩增性和可多向分化性,是理想的组织工程种子细胞,用于构建工程组织。实现这一目标的主要障碍在于如何在体外模拟生理环境培养骨髓间充质干细胞,因此,研究并改进骨髓间充质干细胞体外三维培养至关重要。对近年来骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞的培养方式、培养系统以及培养中的环境因素加以评述。     

利用成体干细胞体外小口径血管的构建

设计了一套血管生物反应器系统,采用有限元的方法对组织工程小血管托架材料进行了分析,从而开发完成了一套用于构建直径为2 mm的小血管托架;通过收集人的原代骨髓基质干细胞(hBMSCs)和脂肪基质干细胞(ADSCs)进行体外扩增和培养,并选用第3代细胞与聚羟基乙酸酯(PGA)复合后置于血管生物反应器中动态培养;在生物反应器中动态培养4周后,对材料复合物进行取材,分别进行大体观察、HE染色和扫描电镜等指标检测.结果表明:血管色泽明亮,有一定的弹性,细胞分泌的胶原基质排列较规则,免疫组化结果表明血管含有平滑肌弹性肌动蛋白的成分.说明改进的血管生物反应器能模拟血管的力学环境,并能利用人骨髓间充质干细胞扣脂肪基质干细胞成功构建组织工程小血管组织.     

重组人转化生长因子β1在CHO/dhfr~-细胞中的稳定表达和纯化

构建了含重组人转化生长因子β1(rhTGF-β1)基因的真核表达载体,并利用阳离子脂质体介导的方法,将构建的表达载体转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型哺乳动物细胞CHO/dhfr-中,通过氨甲喋呤(MTX)加压筛选获得稳定表达重组人转化生长因子β1的细胞株.于14L细胞发酵罐进行扩大培养,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测得表达量在3mg/L左右.采用亲和层析、反相层析及分子筛凝胶层析的方法分离纯化,获得的rhTGF-β1试制品的纯度大于97%,得率在25%以上.通过基质辅助激光解析电离化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定rhTGF-β1的分子量为25.470ku,与理论分子量一致.N端蛋白序列分析仪分析其N端氨基酸序列,与理论的氨基酸序列一致.rhTGF-β1具有抑制水貂肺上皮细胞Mv-1-Lu增殖的活性,测定其比活为3.2×107 IU/mg,与商品化的rhTGF-β1标准品相当.本研究为进一步规模化制备rhTGF-β1奠定了基础.     

精原干细胞体外培养的方法改进

探讨精原干细胞体外培养优化方法,为进一步探讨其生物特征、生殖干细胞移植及生殖损伤及药物保护等研究提供实验基础.制备骨髓基质饲养层,将生后5 d~7 d雄性小鼠生精细胞接种在饲养层上,并于IMDM培养基及37 ℃下共培养,在倒置显微镜下观察细胞生长行为,并对培养后的细胞进行组织学、细胞化学、免疫组化、遗传学鉴定.精原干细胞能在以骨髓基质细胞饲养层上进行增殖和生长,且增殖后的表现出呈簇、团状生长,细胞间可表现出明显的胞质间桥,细胞核大,核/质比高,碱性磷酸酶及C-KIT受体阳性,染色体核型为20对(40条)等精原干细胞的生物学行为特征.原代培养的骨髓基质细胞作饲养层具有取材及制作简便等优点,且能在不添加外源性生长因子的前提下能通过自分泌足够的细胞生长因子,满足精原干细胞体外增殖和抑制分化的需要,是精原干细胞培养的一种良好的饲养层.IMDM培养基、血清及适宜的环境温度是精原干细胞体外培养的重要条件.     

成人骨髓间充质干细胞体外扩增和定向诱导分化为骨和软骨细胞的研究

体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSC)向骨细胞和软骨细胞分化.从正常成人骨髓中分离MSC,经纯化和扩增后分别用地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导MSC向成骨细胞分化;用无血清培养基和转化生长因子-β诱导MSC向软骨细胞分化;诱导期间用光镜检测分化情况,并通过细胞化学和免疫组化方法检测钙沉积、碱性磷酸酶、软骨细胞分泌的酸性蛋白聚糖以及Ⅰ和Ⅱ型胶原表达情况.5.5×105个成人骨髓MSC在体外扩增15代后可获得7.5×1012个细胞,扩增约1.36×107倍;在地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C诱导培养的第7天,光镜下可观察到少数细胞逐渐由梭形变成多角形,碱性磷酸酶呈阳性,于培养的第21天可观察到钙沉积,Ⅰ型胶原呈阳性反应.成人MSC在无血清培养基中和TGF-β诱导下可向软骨细胞分化,阿茜蓝染色可观察到蓝染的酸性蛋白聚糖,Ⅱ型胶原呈阳性反应.因此,成人骨髓MSC在体外可定向诱导分化为骨细胞和软骨细胞.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及生物性状研究

分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓间充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。冷冻保存细胞复苏后的生长状况观察。结果显示，原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。     

人胎儿骨髓间充质干细胞的分离及生物学鉴定

通过原代细胞培养,从引产胎儿骨髓组织中分离干细胞,然后进行生物学鉴定,旨在体外建立培养胎儿骨髓干细胞的有效方法,为进一步研究干细胞奠定基础．本研究对四个月的引产胎儿骨髓组织进行原代细胞培养,采用贴壁筛选法,在含有15％胎牛血清的L-DMEM／IMDM(1:1)混和培养液中培养,7 d后细胞可长满瓶底．显微镜下观察,细胞形态均一,呈长梭形．传代后,在8代以内的细胞贴壁能力较强,生长速度较快．将其命名为BMMS-03．在第3代时,对培养的细胞进行了于细胞标志物的生物学鉴定,采用流式细胞仪对经免疫荧光染色的细胞进行检测．结果显示:97．2％的细胞呈CD105阳性反应,66．0％的细胞呈CD106阳性反应, 9．2％的细胞呈CD34阳性反应．阴性对照组阳性反应为0．5％．生物学鉴定的初步结果提示,从胎儿骨髓组织中分离培养成功的细胞为骨髓间充质干细胞,其细胞形态学特征、CD105 、CD106 和CD34-的检测结果均符合间充质干细胞的特征．本研究成功地建立了体外培养胎儿骨髓间充质干细胞的有效方法,所获得的间充质干细胞纯度较高,增殖较快,适用于干细胞生物学和组织工程学的研究．     

骨髓间充质干细胞旁分泌IGF-1体外调节胰岛瘤细胞

采用体外共培养技术探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外调节胰岛瘤细胞功能的可能机制.将培养的细胞分为:大鼠胰岛瘤细胞系(INS-1)单独培养的三组(培养的INS-1细胞系、培养的INS-1细胞系+IGF-1、培养的INS-1细胞系+NVPAEW541)、培养的INS-1细胞系加BMSCs上清液后培养组的三组(培养的I...     

hMSCs的成骨定向分化及与PLGA/TCP的相容性

为验证人骨髓间充质干细胞(h MSCs)的成骨定向分化,将成骨分化培养基培养作为成骨组,完全培养基培养作为对照组进行实验.VON KASSA染色结果显示:h MSCs具有良好的成骨分化能力,钙结节明显;碱性磷酸酶(ALP)酶活性检测结果显示:成骨组的ALP酶活性明显高于对照组(P0.01),在12 d达到峰值,随后进入平台期.为验证h MSCs和聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP)的相容性,将PLGA/TCP上培养作为立体培养组、平面上培养作为平面对照组进行相关分析,扫描电镜结果显示细胞能在材料上粘附生长并进行成骨分化,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测结果显示立体培养组的增殖率在5和7天时要明显高于平面对照组(P0.01),ALP酶活性检测结果显示立体培养组的成骨分化效果在3、5、7天时要好于平面对照组(P0.05),证明h MSCs和PLGA/TCP具有良好的生物相容性,两者具有结合生成组织工程骨的潜力.     

神经元素3蛋白(Ngn3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素表达细胞分化的初步研究

胰腺发育相关基因神经元素3（neurogenin3,Ngn3）,属于碱性螺旋-环-螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）家族的转录因子,对胰腺内分泌细胞的发育及分化至关重要,且被认为是胰腺祖细胞的标志蛋白质．之前的研究发现,全长Ngn3蛋白具有蛋白质转导功能,可以高效进入多种真核细胞系．近年来多项研究显示,骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞．利用蛋白质转导技术,将体外表达纯化的胰腺发育重要因子Ngn3蛋白导人体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞中,诱导其向胰岛素表达细胞分化．结果显示,经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞出现细胞聚集生长现象,并有形状类似胰岛的细胞团出现．RT-PCR结果显示经Ngn3蛋白诱导的大鼠骨髓间充质干细胞可以有效表达胰岛素,并且一些β细胞相关基因如胰十二指肠同源盒基因-1（pancreatic-duodenal homeoboxl,Pdx-1）,神经分化因子（neurogenic differentiation,NeuroD）,同源结构域基因4（pairedboxgene4,Pax4）,葡萄糖转运体-2（gluoase transporter2,Glut-2）都有表达．细胞免疫荧光也可检测到胰岛素的表达．通过Ngn3蛋白质诱导分化大鼠骨髓间充质干细胞的初步研究,探索了应用骨髓间充质干细胞体外诱导分化获得胰岛素表达细胞的可行性,为糖尿病治疗提供一定的实验依据．     

人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养.发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的.