花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)黑腐病抗性基因同源序列分离及克隆的研究

通过从NBS保守序列设计简并引物PCR的方法，以花椰菜（Brassica oleracea var．botrytis）抗、感黑腐病的近等基因系为材料，分离得到NBS-LRR型抗性基因同源序列，并获得1个克隆，命名为RGA330—7．Southern杂交表明，该片段在近等基因系中存在明显的多态性，且该片段在抗黑腐病基因位点至少存在3个以上类似RGA330—7的同源拷贝．序列分析结果认为该克隆与NBS—LRR型抗性基因的部分CDSs有很高的同源性，说明该片段属于NBS—LRR型．系统进化分析该序列与甘蓝型油菜的2个抗病同源序列归为一类，很可能这3个不同来源的抗性基因同源序列同属于一种抗性基因家族．因此推测该序列与花椰菜抗黑腐病基因紧密相关，为进一步克隆花椰菜抗黑腐病基因提供了可靠的候选基因，对分子标记辅助抗性育种具有重要意义。     

利用AFLP-银染法筛选与抗甘蓝黑腐病性状连锁的分子标记

利用ＡＦＬＰ－银染法在一对花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中筛选到四个与抗黑腐病性状、一个与感黑腐病性状连锁的ＤＮＡ 分子标记．对其中一个４００ｂｐ 的抗病标记进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测,结果表明该标记在抗病品系中存在明显的杂交信号,而在感病品系中无杂交信号．该标记测序后,通过Ｇｅｎｂａｎｋ 进行同源性检测,发现其与拟南芥菜ＢＡＣ克隆Ｆ７Ｎ２２ 部分序列有７５％ 的同源性．该ＢＡＣ克隆位于拟南芥菜５ 号染色体的黑腐病抗性基因（ｒｘｃ２）附近．这意味着该标记可能与甘蓝黑腐病抗性基因紧密连锁．     

与花椰菜(Brassica oleracea ssp.botrytis)抗黑腐病基因连锁的RAPD标记

利用 RAPD技术 ,在花椰菜 ( Brassica oleracea ssp.botrytis)抗感黑腐病的近等位基因系之间进行 1 0碱基随机引物的筛选 .34 5条 RAPD引物扩增的产物表明 ,有 7条引物在近等基因系中呈多态性 .进一步的重复实验表明 ,只有引物 OP2 2 4能够产生稳定的多态性 .为了确定扩增产物 OP2 2 4/1 6 0 0与抗黑腐病基因的连锁程度 ,利用 F2分离群体进行检测 ,结果表明 :花椰菜种质 C71 2抗黑腐病生理种 BJ的抗性由一对显性基因控制 .RAPD标记OP2 2 4/1 6 0 0与抗病基因连锁 ,其遗传距离为 ( 4 .5± 1 .37) c M     

定向筛选抗枯萎病棉花的抗病相关基因条带的鉴定

以天九63号棉花品种和其经过病圃定向筛选2年、3年分别对枯萎病菌7号生理小种表现高感、耐病和抗病的材料为研究对象,利用差异显示PCR技术对接种枯萎病菌前后的抗、感材料中差异表达的基因进行了初步研究,结果共得到62个差异条带。进一步通过反向Northern杂交验证,发现其中有8个是抗病诱导增强的阳性条带。经克隆、测序和同源性比对分析,结果表明：除14-3片段没有找到同源性外,其余的差异条带都可以找到同源性较高的序列。其中10-5和22-11与盐胁迫下松科植物的抗菌素cDNA同源性达到100%,22-6达到96%,22-2与缺氮条件下松科植物cDNA的同源性为100%,推断其与植保素类物质的调控和生成相关;13-10与陆地棉纤维的cDNA同源性为100%,蛋白质序列比对发现它编码磷酸氧化酶相关的维生素类物质,推断其参与抗病相关酶类的合成途径;差异条带6-3与棉花根茎部幼嫩组织和纤维的cDNA同源性为99%,与陆地棉胚珠cDNA同源性为98%;10-7与假定的衰老相关蛋白mRNA同源性为98%。     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

褐飞虱细胞色素P450基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱细胞色素P450基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为237bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自烟草天蛾、棉铃虫、埃及伊蚊、家蝇、黑腹果蝇和线虫的CYP6家族的P450的氨基酸序列存在同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,P450基因的表达水平明显升高.以上结果表明,P450基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在褐飞虱对抗性水稻的耐受性和解毒方面可能起着重要作用.     

簇毛麦中谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与表达分析

利用抑制性消减杂交(SSH)方法克隆差异表达片段EST639,从簇毛麦cDNA文库中筛选到一个类谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)的全长cDNA,命名为HvGSTF.该序列长1 232 bp,具完整的开放阅读框(ORF),编码一条含229个氨基酸残基的多肽,推导其分子量为25.6 kDa,等电点为4.89.该多肽的氨基酸序列与小麦、水稻、大麦、玉米、拟南芥的类GST分别具有83%,63%,61%,52%和47%的相似性.Northern杂交表明,HvGSTF在抗、感病簇毛麦叶片中都为组成型高表达,但在受白粉菌侵染的抗、感病簇毛麦中的表达模式不同,却与活性氧的积累模式存在着一致性,推测HvGSTF在簇毛麦细胞免受活性氧毒害方面起着重要作用.     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭(Anas platyrhynchos domesticus)和绿头野鸭(Anas platyrhynchos)卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA(同源性为96%)、褐家鼠睾丸cDNA(同源性为83%)有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

人RS21-C6基因的克隆及其原核表达

从小鼠胸腺细胞克隆的新基因RS21-C6的cDNA648bp与人表达序列标签(EST)数据库进行同源性比较,得到71个EST片段,通过EST拼接获得一致性序列,经设计引物,并采用RT-PCR方法,从人新生儿脐带血单个核细胞、肝脏、淋巴结及Jurkat细胞系cDNA中扩增出一700bp的片段,利用快速扩增cDNA末端(RACE)方法,扩增其5′和3′端序列,得到此基因的全长序列(1118bp),其中包含一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸.该基因在核酸水平与小鼠基因的同源性为83%,其演绎蛋白水平的一致性为75%,相似性为83%.此基因的GenBank登录号为AF210430.此外,已成功表达此基因的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-RS21-C6融合蛋白,其表达量占总菌体蛋白的32.5%.