小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析

实验利用RT-PCR技术，在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋白基因的cDNA，并且含有完整的5′端，将该基因命名为Tufd1，利用RACE技术克隆了该cDNA的3′端。根据这2段cDNA克隆，设计特异引物，利用RT-PCR扩增出了Tufd1完整的开放读码框(ORF)，其编码区长948bp，编码315个氨基酸的多肽，在NCBI中运行BLAST。分析表明，Tufd1蛋白同拟南芥的UFD1蛋白有74％的同源性，在所编码的多肽链的N-端有UFD1保守结构域，可作为催化蛋白降解的信号。     

牛酪蛋白cDNA基因克隆的改建

牛酪蛋白全长cDNA克隆pB_aS_1C184经Bgl Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,回收其中的酪蛋白基因编码片段,与经BamH Ⅰ、SmaⅠ双酶切的植物表达载体pBI121.2分两步连接:第一步载体的BamHⅠ末端与酪蛋白基因的BglⅠ粘性末端连接;第二步用T_4DNA多聚酶补平酪蛋白基因的EcoR Ⅰ末端,再与载体SmaⅠ进行平末端连接而环化,转化JM109菌株,从得到的33个转化子中,通过~(32)P标记的酪蛋白cDNA基因为探针,点杂交筛选到一个阳性克隆。经酶切鉴定,确认酪蛋白cDNA基因编码区已正确插入到pBI121.2中。     

苜蓿花叶病毒RNA2 3''''端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1／2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AIMV-Ch)RNA：3′端cDNA，重组到植物表达载体pROKⅡ中，通过致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导，以叶圆片为转化材料，转化普通烟草，并获得了转基因植株．经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明．AIMV RNA：3′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中．转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性．     

人C2H2型锌指蛋白基因ZNF194全长cDNA的克隆

用一个含有锌指编码序列的人ｃＤＮＡ片段（Ｌ２￣９）作为探针杂交筛选人肝组织ｃＤＮＡ分子库，得到８个杂交阳性克隆，经测序和拼接后，将其整合为一条长１８３８ｂｐ和ｃＤＮＡ序列，该序列的２２１￣１６４２ｂｐ为一个完整的开放阅读框，编码了一个由４７３个氨基酸组成的蛋白质，１￣２２０ｂｐ为５′－ＵＴＲ，１６４３￣１８３８ｂｐ为３′－ＵＴＲ，在１８０１￣１８０６ｂｐ有一个加尾信号序列ＡＡＴＡＡＡ，３′端为１８     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA的克隆和序列分析及其在大肠杆菌中的表达(英文)

以poly(A)~ mRNA为模板,噬菌体λgt 10 DNA为载体构建了黑曲霉3758的cDNA的文库。用编码黑曲霉葡萄糖淀粉酶329—418位氨基酸的DNA顺序(456bp)作探针从该文库中筛选葡萄糖淀粉酶cDNA。采用原位噬菌斑杂交法获得11个阳性噬菌斑,从其中6个噬菌体中提取DNA进行限制酶切分析和印迹法转移杂交试验,发现这些阳性噬菌体DNA含有不同大小的插入片段,它们都能与DNA探针杂交,表明已克隆了葡萄糖淀粉酶的cDNA。采用单酶切及交叉双酶切法制定了2.1kbcDNA的物理图并对2.1kb片段作了全序列分析。序列分析结果显示,克隆的2.1kb片段含5＇端非编码区,编码葡萄糖淀粉酶的结构基因及3＇端非编码区。克隆的cDNA片段转移至表达载体λgt11,感染大肠杆菌后,产生的噬菌斑转移硝酸纤维素滤膜后与~(125)I标记的抗葡萄糖淀粉酶抗体进行免疫反应,结果证明含2.1kbcDNA的λgt11表现葡萄糖淀粉酶阳性.2.1kb片段也曾转至质粒pPL2,转化大肠杆菌JF1125。细胞裂解物在SDS-PAGE电泳中可看到新的蛋白带。这些结果表明,克隆的黑曲霉葡萄糖淀粉酶cDNA可以在大肠杆菌中表达。     

129小鼠CgA基因cDNA 5′端部分片段及CgA基因的克隆

通过RT-PCR方法,从129小鼠脑组织中克隆到CgA基因cDNA 5′端部分片段,序列分析结果表明,所克隆到的片段序列与文献中完全一致。以此片段为探针,从129小鼠基因组库中筛选获得阳性噬菌体1-1,克隆了CgA基因,并与文献中的小鼠CgA基因限制性内切酶图谱进行了比较分析。     

人表皮生长因子（hEGF）基因合成及在枯草杆菌BS9920中分泌表达

采用PCR技术人工合成了一段长约175bp的人表生长因子（hEGF)的基因片段，为了便于克隆，在该片段的5′端设计了Pst I的酶切位点及与pUS186载体signal sequence相连接的碱基部分，在3′端设计了HindⅢ的酶切位点及终止密码子，经DNA分析，合成的片段与已发表的hEGF在序列上完全一致，之后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体pUS186上，构建重组载体pUSE并转化一株枯草杆菌突变菌株BS9920感受态细胞，以PCR法快速筛选重组菌落，RIA检测结果表明BS9920阳性转化子能够表达和分泌hEGF。     

苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草及其抗病性研究

将本室克隆的编码复制酶基因3′端约1/2序列及其3′端非编码区的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA,重组到植物表达载体pROKII中,通过致瘤农杆菌(A-grobacteriumtumefaciens)介导,以叶圆片为转化材料,转化普通烟草,并获得了转基因植株.经卡那霉素抗性选择、PCR检测目的基因证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中.转基因植物的攻毒试验表明转基因植株对苜蓿花叶病毒产生高水平的抗性.     

豌豆cop1 cDNA的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥cop1 cDNA为探针,从豌豆(Pisum sativum) cDNA文库中克隆到了豌豆cop1 cDNA。序列分析表明,它全长为2863bp,其中包括604bp 5′非编码区、243bp 3′非编码区和2016bp编码区,编码672个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆cop1基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄3种植物cop1的序列同源性比较表明,cop1可能是一种进化上很保守的蛋白质。     

人Oligophrenin 1样(OPHN1L)基因的克隆

将人Oligophrenin 1(OPHN1)基因编码区2406 bp与EST数据库进行同源性分析,得到一个363 bp的EST AA035622与OPHN1基因编码区一致性为62%,该EST与一个cDNA序列AB014521完全匹配.在ABO14521中设计引物与cDNA文库载体臂上引物行巢式PCR扩增并进行5′RACE,在胎盘cDNA文库中获得cDNA序列606bp,与AB014521拼接成一个6906 bp的cDNA序列,其中包含一个2442 bp的开放阅读框,编码813个氨基酸.该cDNA序列的GenBank登录号为AF141884,并经GDB命名委员会命名为OPHN1L基因.OPHN1L基因3′端与大规模测序的BAC克隆AC005348及AC004782完全匹配,从而将该基因定位于5q21.2～q21.3,并由此获得它的部分基因组结构.     

人核蛋白P68 cDNA基因克隆及全序列测定

靠人合成４个混合聚核苷酸探针，从一个人盘λｇｔ１１ ｃＤＮＡ库筛选到含有ｐ６８ ｃＤＮＡ基因的阳性噬菌斑。经次克隆得到含ｐ６８ ｃＤＮＡ基因的ｐＢＲＢｔ７－ｐ６８质粒。用末端终止法对此ｃＤＮＡ基因进行了全序列测定。分析结构证明得到的ｐ６８ｃＤＮＡ基因含有２２８７３个苷酸，具有一个可阅读框架，共编码６１４个氨基酸。其５＇端非编码区含有１３０个碱基。３＇端非编码区含有３１５个碱基，比已发表的３＇端非     

Cloning of a novel gene encoding human thioredoxin-like protein

mRNA differential display (DDRT-PCR) has been used to analyze different human fetal brain tissues of different developmental stages (13- and 33-week). According to the sequence of one EST obtained in this assay, a pair of primers have been designed to screen the arrayed human fetal brain cDNA library. A1 .2-kb cDNA clone has been found. This cDNA consists of an 867 bp open reading frame, a 132 bp 5' untranslated sequence and a 209 bp 3' untranslated sequence with a typical polyadenylation signal. The coding region predicts a protein of 289 amino acids. Its N-terminal of 105 residues is highly homologous to human thioredoxin, while no homology has been found in the databases with its C-terminal of 184 residues. Its N-terminal region also contains the conserved active site sequence CGPC (Cys-Gly-Pro-Cys) of thioredoxin. It was named human Thioredoxin-like gene (hTRXL).     

Construction of cDNA library, nucleotide sequence and analysis of entire genome of classical swine fever virus strain Shimen

According to the previously published CSFV sequences, 18 pairs of primers have been designed and synthesized, which cover the entire genome of CSFV strain Shimen. Each cDNA fragment has been amplified by RT-PCR from the anticoagulant blood of strain Shimen infected pig. The PCR products have been cloned respectively and sequenced. Results show that the cDNA library of strain Shimen and its nucleotide sequence have been obtained. The genomic RNA of strain Shimen is 12 298 nucleotides in length, containing a 5' and a 3' noncoding region 373 and 231 nt long respectively. The center of genome is a single large open reading frame of 11 697 nt which encodes a polyprotein of 3 898 amino acids. The entire sequence of strain Shimen has also been compared with that of other CSFV strains.     

重组人粒细胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表达研究

根据人天然粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因序列设计出引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ从人外周血单个核细胞ｍＲＮＡ获得Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段,将该片段与原核表达载体ｐＴ７构建成重组体,导入大肠杆菌后发现天然Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达量并不理想,这可能是由于天然ｈＧ－ＣＳＦ５’端Ｇ＋Ｃ的比例过高,使转录后的ｍＲＡ很容易形成二级结构而影响翻译起始,因此在大肠杆菌中很难获得高效表达,根据密码子简并性原则,在不改变编码氨基酸顺序的前提下,通过重新设计ＰＣＲ引物,将ｈＧ－ＣＳＦ的前３个氨基酸密码子中的几个ＧＣ碱基作了改动,获得了新的ｃＤＮＡ突变体,将其与ＰＴ７的重组导入大肠杆菌,获得了高效表达。     

人RNA解旋酶基因家族新成员DVH的克隆与初步功能研究

一条长3446bp 的人类新基因cDNA已从胎脑cDNA文库中被克隆,该cDNA克隆包长2583bp的开放读框,推测编码一条长860个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为96．8ku,通过同源性比较及profile搜索,预测氨基酸序列显示出DExH-BOX RNA解旋酶基因家族特有的7保守基序及已知RNA解旋酶氨基酸序列的较高同源性,进一步通过蛋白质结构模型同已知RNA解旋酶结构的比较,可以认定其为一条人类RNA解旋酶基因家族新成员,通过基因编码的氨基酸序列中基序II D－E－V－H残基将其命名为DVH（DEVHbox Helicase),生物信息学手段结合DVH基因表达谱分析结果可推定DVH可能在胎儿发育过程中起作用,由于解旋基因家族同人类遗传疾病关系密切,以上结果可指导DVH基因的进一步功能研究并提示该,基因作为疾病侯选基因的可能性。     

Isolation and Characterization of Phytoene Desaturase cDNA from Stigma of Crocus sativus

Phytoene desatumse (PDS) has recently been identified as an important enzyme in carotenoid biosynthesis pathway. A cDNA clone encoding phytoene desaturase gene is isolated from stigma of saffron (Crocus sativus L. ) using RT-PCR technique. Sequence analysis shows 85% similarity to Narcissus pseudonarcissus, 79% to Zea mays, 78% to Arabidopsis thaliana, 77% to Lycopersicon esculentum. A new full-length cDNA is obtained by 5 ‘-RACE and 3‘ -RACE techniques. The cDNA is 2149bp long with an open reading frame of 1697bp, which encodes a polypeptide of 565 amino acids. Southern analy-sis shows that the PDS gene is a single copy in saffron. Northern blot analysis shows higher expression level of PDS gene in stigma and anther than in leaves and stem.     

Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2

A cDNA coding for human interleukin-2 (IL-2) has been cloned from a cDNA library prepared from partially purified IL-2 mRNA. The DNA sequence codes for a polypeptide which consists of 153 amino acids including a putative signal sequence. A biologically active polypeptide, characteristic of human IL-2, was produced when the cDNA was fused to a simian virus 40 promoter sequence and used to transfect cultured monkey COS cells.     

人Rab蛋白cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的Rab cDNA,全长920bp,以编码213个氨基酸残基,该蛋白预测的分子质量为24567u,等电点7．34,经同源比较,该cDNA与GenBank数据库中登录号为X14964的Rab蛋白有83％的相似性和76％的相同性,将该cDNA克隆到经改造的PBV220表达质粒,转化DH5a菌株诱导表达出该蛋白,取24种不同组织的总cDNA各100ng,用该基因序列设计引物作PCR,结果在胎肝组织中检测到有明显条带,表明该Rab基因相对在胎肝有高表达。