人胰岛素原类似物（B-Arg-Arg-A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（PCR）法将C肽为6个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成C肽仅为2个精氨酸残基的胰岛素原类似物（BArg-Arg-A）基因,即把pUC18BC'A改建为pUC18BR₂A。再将pUC18BR₂A与pJG105重组为表达质粒pJG107,使B-Arg-Arg-A与pJG105编码的一种多肽构成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的58%。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

去B链羧端三肽人胰岛素原的基因构建和表达

用改进的寡苷酸诱导 突变法将人胰岛素原基因（ＢＣＡ）删除编码Ｂ链羧端三肽的碱基片段，得到去Ｂ链羧端三肽胰岛素原的基因（Ｂ＾－３ＣＡ）。为了便于表达产物的蛋白质后加工，又用ＰＣＲ的方法在Ｂ链Ｎ端起始Ｍｅｔ与Ｐｈｅ密码子之间增加了编码Ｌｙｓ的３个碱基，得到改造后基因ＬＢ＾－３ＣＡ，将ＬＢ＾－３ＣＡ克隆到表达质粒ｐＢＶ２２０上，在大肠杆菌系统中热诱导表达，表达率为１２％。表达产物经蛋白质后加工，得到的去     

人胰岛素原类似物（B—Arg—Arg—A）基因的构建和表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法将Ｃ肽为６个氨基酸残基的胰岛素原类似物基因删除突变成Ｃ肽仅为２个精氨酸残基的胰岛类原类似物基因，即把ＰＵＣ１８ＢＣ＇Ａ改建为ＰＵＣ１８ＢＲ２Ａ。再将ＰＵＣ１８ＢＲ２Ａ与ＰＪＧ１０５且为表达质粒ＰＪＧ１０７，使Ｂ－Ａ－Ａ与ＰＪＧ１０５编码的一种多肽成融合蛋白在大肠杆菌体系中表达。融合蛋白占细菌蛋白总量的５８％。表达产物具有人胰岛素放射免疫活性。     

重组羧肽酶B在胰岛素原C肽制备工艺中的应用

用RT-PCR方法克隆了大鼠羧肽酶原B的cDNA编码序列,将其重组到原核表达质粒pT7-473中,并在大肠杆菌中以包涵体方式获得高表达。SDS-PAGE电泳及灰度扫描显示表达量达菌体总蛋白的35％,表达产物融合了表达质粒上的6His。在变性条件下,经Ni-NTA柱纯化,得到羧肽酶原B,在复性液中进行稀释复性后,胰蛋白酶切得具酶活性的羧肽酶B,然后经DEAE-FF分离纯化获得较纯的羧肽酶B(28．5mg／L),比活为13．5u／mg。用RP-HPLC分析胰蛋白酶 羧肽酶B酶解胰岛素原C肽三聚体的酶解产物,证明该重组的羧肽酶B可替代提取的羧肽酶B应用于胰岛素原C肽的制备工艺中。     

胰岛素样人参肽的氨基酸序列测定

用DABITC/PITC双偶合微量手工液相顺序方法测定了胰岛素样人参肽的氨基酸序列为Glu-Thr-Val-Glu-Ile-Ile-Asp-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-Asp-Ala,与氨基酸组成分析相符。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

重组人胰岛素及C肽的分离纯化

对基因工程构建的含重组人胰岛素和C肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达，工程菌用甲醇诱导72 h后，离心去除菌体，上清液经中空纤维膜超滤后SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析，0~400 mmol/L NaCl梯度洗脱，得到纯度大于92％的重组人胰岛素原。经Lys-C酶和羧肽酶B酶切后，Sephadex G-25柱分离，得到了重组人胰岛素和C肽。     

人胰岛素A链与B链基因的化学合成,克隆与表达

采用大肠杆菌密码子，用化学法分别合成人胰岛素２１个氨基酸的Ａ链，３０个氨基酸的Ｂ链，并在基因的５端引入甲硫氨酸密码子，尾部加入终止密码，两端加入限制性内切酶，Ａ链为８３个核苷酸，Ｂ链为１１０个核苷酸，经纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接反应后，分别克隆了人胰岛素Ａ、Ｂ链基因，然后选用ＰＬ启动子，构建了以牛生长前１３４个氨基酸的大片段基因，分别与人胰岛素Ａ链、Ｂ链基因的融合基因的融合基因的表达质粒ＰＬＷ     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

人胰岛素原DNA疫苗的构建与鉴定

构建1型糖尿病关键自身抗原胰岛素原（Proinsulin）的DNA疫苗,并在体外对其表达产物进行鉴定。从人胰腺cDNA库用半巢式PCR扩增出编码Proinsulin的cDNA,克隆入载体PGEM－T中,再将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建重组载体pcDNA3.1( )／Proinsulin,测序后在真核细胞COS－7中进行体外短暂表达,Western印迹法对其表达产物进行鉴定。结果克隆的人Proinsulin基因,测序表明其cDNA序列与Genbank公布的序列基本相同,仅在第63位氨基酸（C肽区）有一CAG（Glu)→CGG（Arg）的突变,Western免疫印迹法证实DNA疫苗在COS－7细胞中有效地获得了表达。结果说明运用基因克隆方法构建的Proinsulin DNA疫苗,在真核细胞内能有效地表达Proinsulin重组抗原。该疫苗的构建成功,为1型糖尿病的免疫干预提供了实验基础。     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

纳豆激酶原基因的克隆及表达

从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因，与质粒PBV220连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达，用SDS－PAGE电泳鉴定，在38kD处有一条明显的带，占菌体蛋白的20％左右，同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。     

松墨天牛原肌球蛋白基因的克隆和表达检测

利用先前构建的cDNA文库和RACE方法,克隆了松墨天牛原肌球蛋白基因的cDNA全长,该序列长1 203 bp,命名为MaTm(GenBank登录号:KM099072),其中开放阅读框长852 bp,编码283个氨基酸.MaTm的氨基酸序列与赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)相似性最高,为97%,与家蚕相似性 (Bombyx mori)为94%.松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一个分支上.用 RT-qPCR 分析了MaTm的相对表达量,结果显示:蛹和幼虫的表达量低于成虫;成虫足和头的表达量高于对照;在幼虫各组织中均有表达,且差异显著(p0.05),其中在体壁的表达量最高.     

A链链内二硫键移位突变胰岛素原的构建与表达

采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础.     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

不同糖耐量人群尿C肽肌酐比值与胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的关系研究

目的探讨不同糖耐量人群尿C肽肌酐比值与胰岛β细胞功能和胰岛素抵抗的关系.方法选取内分泌科就诊患者,根据75 g葡萄糖耐量检查结果分为正常糖耐量组72例,糖调节受损组54例,Ⅱ型糖尿病组94例.行静脉葡萄糖耐量实验,检测0~10 min胰岛素水平,计算急性胰岛素反应(AIR3-5)、0~10 min胰岛素曲线下面积(AUC)、稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛β细胞功能指数(HOMA-β);留取受试者清晨空腹第1次、第2次尿液样和24 h尿样本,酶法检测尿肌酐值,化学发光法检测C肽水平,计算C肽肌酐比值.结果糖调节受损组、Ⅱ型糖尿病组空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹胰岛素、餐后2 h胰岛素、糖化血红蛋白、HOMA-IR均明显高于正常糖耐量组,差异具有统计学意义(P0.05);而肾小球滤过率在3组间差异无统计学意义(P0.05).糖调节受损组、Ⅱ型糖尿病组AIR3-5、AUC、HOMA-β、第1次尿C肽肌酐比值、第2次尿C肽肌酐比值、24 h尿C肽明显高于正常糖耐量组,差异具有统计学意义(P0.05).第1次和第2次尿C肽/尿肌酐比值与AIR3-5,AUC,HOMA-β呈负相关,与HOMA-IR呈正相关,其中以第2次C肽尿肌酐比值相关性最佳.结论尿C肽肌酐比值在Ⅱ型糖尿病及糖调节受损个体中明显升高,且与胰岛β细胞第一时相分泌功能、胰岛素抵抗有直接相关性.     

P16基因及其表达在非小细胞肺癌中的研究进展

目的：使我们对P^16基因及其表达在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)的早期诊断及治疗从分子水平上有进一步的认识。方法：就P^16基因在NSCLC人中的近期研究进展作一综述。结果：P^16（也称多肿瘤的抑制基因，MTS1和CDKN2)，它是一种抑癌基因。原发性NSCLC组织均可出现P^16／P^15基因纯合性丢失。肺鳞癌组织P^16基因的甲基化明显高于其它组织类型。在NSC比中病期愈晚P^16蛋白缺失越明显。被检病人痰及血中的P^16基因异常，有助于NSCLC的早期诊断。P^16和P^53基因联合共转染能显增强对NSCLC细胞增殖的抑制。结论：P^16基因及其表达蛋白与NSCLC的发生、发展、转移密切相关，应用于NSCLC的早期诊断及治疗。     

抗栓胰岛素原钙调素重组融合蛋白表达条件的摸索

以无活性人胰岛素原突变体为分子支架,在C肽位置嵌合特异拮抗血小板GPⅡbⅢa受体的去整合素活性结构位点序列,构建嵌合人胰岛素原突变体.该突变体相对分子质量大小为7.0×103,与钙调素的C末端融合后形成新型重组融合蛋白质,相对分子质量为24.7×103.构建该重组融合蛋白质的大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,尝试在大肠杆菌表达体系中,对该重组融合蛋白质进行高效表达.结果表明,该重组融合蛋白质的表达率约占菌体全蛋白的30%,优化后的表达条件为25℃,50μmol.L-1诱导表达16 h.     

草鱼原肌球蛋白基因的克隆及其组织表达

为揭示原肌球蛋白基因在草鱼肌肉中的作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得了草鱼原肌球蛋白基因c DNA,并对该基因在普通草鱼和脆肉鲩不同组织中的表达情况进行研究分析。结果表明原肌球蛋白基因c DNA全长序列为1 705 bp,包含387 bp的5′UTR序列,1 307 bp的3′UTR序列和855 bp开放阅读框(ORF)。其ORF编码284个氨基酸。系统进化分析表明普通草鱼与斑马鱼、墨西哥脂鲤的原肌球蛋白基因核苷酸同源性分别是93%和87%,氨基酸同源性分别是96%和93%。在聚类上普通草鱼原肌球蛋白基因与其他鲤科鱼类同源性较高,表明亲缘关系最近,与传统分类相一致。Real time-PCR结果表明原肌球蛋白基因在所检测的普通草鱼和脆肉鲩7个组织中均有表达,原肌球蛋白基因在普通草鱼腹肌中表达最高,其次为前肠。原肌球蛋白基因在脆肉鲩腹肌中的表达低于普通草鱼,而脆肉鲩中肌肉、肝脏、肾脏、前肠、后肠中原肌球蛋白基因表达量大于普通草鱼相对应组织,但差异不显著。     

钙调素-人胰岛素原融合体的酶切加工

通过基因工程方法将人胰岛素原突变体偶联钙调素形成融合态重组蛋白质,在该重组蛋白质中设计具有PRESCI蛋白酶酶切位点.制备PRESCI蛋白酶并对钙调素-人胰岛素原突变体重组蛋白质进行酶切加工.研究表明,该重组融合蛋白质可被有效切割,通过蛋白质纯化手段能够有效地将切割后的钙调素与人胰岛素原突变体进行纯化.