重组腺相关病毒的小量制备与体内体外感染研究

 重组腺相关病毒(rAAV)是近年来发展的较为成熟的一种病毒基因载体, 常用于过表达或者敲低等动物模型的建立与基因治疗等。本研究使用三质粒共转染的方法, 在HEK293细胞中包装出含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的rAAV, 通过一系列实验, 确定纯化方法为脱氧胆酸钠裂解, 高浓度NaCl去除杂蛋白, 最后通过肝素层析柱纯化, 经超滤管浓缩后其滴度可达10¹³ gene copys/mL以上。将纯化后的rAAV 感染HEK293 细胞, 通过实验确定使用感染复数为10⁶、感染3 d 的细胞能够表达出高水平的EGFP。将rAAV注射入大鼠中脑黑质致密部, 经过3周的感染发现, rAAV可以特异性地感染多巴胺能神经元, 表达出EGFP。通过以上实验, 建立了一个在实验室小量制备rAAV的方法, 且此方法制备的rAAV完全满足体内与体外实验的要求。     

重组腺相关病毒质量控制的qPCR技术研究进展

综述实时荧光定量PCR(qPCR)技术在重组腺相关病毒(rAAV)的基因组滴度测定中的应用成果,以及qPCR技术在rAAV质量控制过程中的应用,如感染滴度及rcAAV污染率的测定等.分析qPCR技术存在的适用范围窄、易产生系统性误差和易受rAAV杂质干扰等问题的原因,并探讨相关的解决策略.     

氧化应激促进重组腺相关病毒2型体外转导分析

为揭示氧化应激在重组腺相关病毒2型(rAAV2)转导中的作用,以过氧化氢(H₂O₂)和铁过载(Fe-NTA)氧化应激为模型,在293T,LO-2,Hela,A549细胞中,从转基因表达量、阳性细胞数、基因组数和病毒衣壳分布等方面研究氧化应激对rAAV2转导的影响.实验结果表明:H₂O₂和Fe-NTA能促进rAAV2转导,转基因表达量、阳性细胞数、基因组数与对照组相比的差异具有显著的统计学意义;细胞转导12 h后,氧化应激组核周围衣壳分布数目显著比对照组多,氧化应激能够促使rAAV2长时间聚集在细胞核周围;当氧化应激产生的活性氧(ROS)被N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)消除,则氧化应激促rAAV2转导作用消失,说明氧化应激通过ROS发挥促进rAAV2转导作用.     

表达Kallistatin的9型重组腺相关病毒的制备及其体外表达效率

采用三质粒磷酸钙共转染生产系统,制备出可以表达内源性抗肿瘤血管生成因子(Kallistatin)的9型重组腺相关病毒(rAAV2/9)和2型重组腺相关病毒(rAAV2/2).rAAV经银染法鉴定其纯度;采用WesternBlotting法比较rAAV2/9和rAAV2/2外壳蛋白的大小;qPCR方法检测rAAV的滴度.使用rAAV2/9-Kal-listatin和rAAV2/2-Kallistatin分别感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)后,RT-PCR和ELISA法分别检测Kallistatin的mRNA和蛋白表达水平.结果表明:纯化的病毒纯度达到98%以上;rAAV9外壳蛋白比rAAV2的大.感染HUVEC后,rAAV2/9介导Kallistatin在mRNA和蛋白表达水平都要比rAAV2/2高.     

重组人脑利钠肽制备中内毒素去除工艺研究

[目的]在重组人脑利钠肽(BNP)的分离纯化过程中去除内毒素。[方法]选用Chelating Sepharose FF亲和柱层析、Q Sepharose FF阴离子交换柱层析、Source 15反相柱层析、SP Sepharose FF阳离子交换柱层析组合的方法对BNP进行分离纯化;按照2010版药典中鲎试剂法检测各层析柱纯化阶段得到蛋白溶液中的内毒素含量;并用HPLC方法检测各阶段所得蛋白的浓度和纯度。[结果]BNP制备过程中每一步层析在内毒素去除方面都有良好的效果,内毒素去除率超过90%;最终纯化所得BNP原液内毒素含量降至0.34EU/0.5mg,去除率高于99.99%,蛋白纯度高于98%;[结论]所设计的四步层析纯化分离方法在纯化重组人脑利钠肽的同时也能高效的去除蛋白溶液中内毒素,所得原液内毒素的含量远远低于国家药典对注射剂内毒素含量的最低限制,为重组脑利钠肽的工业化生产奠定了基础。     

宿主细胞DNA损伤反应与重组腺相关病毒载体基因表达

文中主要讨论细胞DNA修复机制与重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体的相互关系,探讨通过调节宿主细胞DNA修复机制,提高rAAV载体表达及基因打靶效率的方法,进而提高rAAV载体基因表达的可能性.     

重组腺相关病毒基因药物三种滴度的比较与分析

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)和转导方法对重组腺相关病毒(rAAV)的衣壳滴度、基因组滴度、转导滴度进行定量,并比较衣壳滴度/基因组滴度(P/GC)和基因组滴度/转导滴度(GC/TU).实验结果表明:3批rAAV的平均衣壳滴度为3.65×10¹³ P·mL^-1,平均基因组滴度为8.67×10¹¹ GC·mL^-1,平均转导滴度为9.85×10⁹ TU·mL^-1,P/GC平均值为41.70,GC/TU平均值为88.20,P/GC和GC/TU平均值接近于AAV2标准品,说明文中方法的制备工艺成熟、稳定,制备的rAAV感染活性较高.     

超滤去除L-乳酸发酵液中蛋白的工艺研究

采用超滤技术从L-乳酸发酵液中分离去除蛋白,研究了超滤过程中的操作压力、操作温度、超滤液的体积和料液初始浓度等主要因素,对膜通量和发酵液中蛋白质及乳酸钙2种主要组分截留率的影响;并确立了采用聚砜膜去除乳酸中蛋白工艺的最佳参数,在此条件下,蛋白质去除率达到91.5%,乳酸钙损失为2%。     

庆大霉素发酵液的超滤过程研究

研究了庆大霉素发酵液的超滤过程.截留分子量30 000、压强0.2 MPa、室温和酸性条件下超滤膜可去除97.85%蛋白质、60.89%COD和99.95%菌体.发酵液稀释0.1倍,可提高79.61%的超滤处理量.通过清洗后水通量可恢复94.93%.超滤可延长阴离子树脂的使用寿命,降低活性炭、阳离子树脂的消耗,节约工业用水.     

腺病毒-腺相关病毒嵌合载体的研发趋势

分析腺病毒-腺相关病毒(Ad/AAV)嵌合载体母体中,3代Ad载体及AAV载体所具有的优势和存在的缺点.阐述Ad/AAV嵌合载体的制备方法、生产工艺,以及其在稳定转染造血干细胞、Duchenne型肌营养不良症(DMD)的基因治疗和人内啡肽基因的表达研究等方面的最新研究进展.同时指出,Ad/AAV嵌合载体是近年发展起来的嵌合病毒载体,它融合了Ad和AAV两种常用的病毒载体的优点,理论上接近理想临床应用的载体,但还需要通过大量的,特别是动物体内的应用研究去检验其优越性,以满足临床治疗需要.     

用絮凝和超滤技术纯化木瓜蛋白酶

用无毒性的絮凝剂ｆｃ－１与无机助凝剂ｆｃ－２对木瓜乳胶水溶液预处理，然后用中空纤维超滤膜进行超滤浓缩，实验结果表明，用絮凝法预处理时，当絮凝条件为ｆｃ－１和ｆｃ－２各为０．２ｇ／Ｌ，ｐＨ为５．０￣５．５时，既解决了膜易污染的问题，又使木瓜酶得到了有效的纯化。在形成浓差极化－凝胶层的情况下，超滤速度随透出液体积和主体溶液浓度增大而减小，随料液错流速率的增大而增大，絮凝预处理有利于超滤速度的提高。     

超滤膜去除地下水中硝基苯的试验研究

为解决持久性有机污染物对地下水造成的污染,以硝基苯为研究对象,考察了超滤膜对硝基苯的去除效果及影响因素。试验结果表明,当进水硝基苯浓度为85μg/L,超滤膜可以连续工作68h,出水小于17μg/L。地下水中铁、锰离子对去除效果没有显著影响。进水硝基苯浓度对去除效果有显著影响。当进水硝基苯浓度由85μg/L上升至340μg/L时,超滤膜连续工作时间急剧下降,仅为14h;对由硝基苯引起的膜污染,2%CH3CH2OH清洗效果最佳。作为一项应急处理技术,该工艺可以保障小城镇地区饮水安全。     

超滤膜去除地下水中硝基苯的试验研究

为解决持久性有机污染物对地下水造成的污染，以硝基苯为研究对象，考察了超滤膜对硝基苯的去除效果及影响因素。试验结果表明，当进水硝基苯浓度为85肛μg/L，超滤膜可以连续工作68h，出水小于17μg/L。地下水中铁、锰离子对去除效果没有显著影响。进水硝基苯浓度对去除效果有显著影响。当进水硝基苯浓度由85μg/L上升至340μg/L时，超滤膜连续工作时间急剧下降，仅为14h；对由硝基苯引起的膜污染，2％CH3，CH3CH2OH清洗效果最佳。作为一项应急处理技术，该工艺可以保障小城镇地区饮水安全。     

超滤对大蒜粗多糖中蛋白质的脱除效果

研究了超滤对大蒜粗多糖中蛋白质的脱除效果．选择截留相对分子质量为10000的超滤膜（MWCO）,并研究了超滤次数、操作压力、样品浓度和膜的清洗方式对超滤效果的影响．结果表明：利用该超滤膜来脱除大蒜粗多糖中蛋白质的最佳条件为：大蒜多糖的质量浓度20mg／mL,压力27．58kPa,超滤3次．该条件下大蒜多糖通过率达到92．1％,蛋白质含量由O．5％降低到了0．05％．超滤膜使用后,不经清洗,再次使用,大蒜多糖的通过率为74．7％,为原通过率的78．1％;经蒸馏水一Na0H溶液一蒸馏水混合清洗后,大蒜多糖的通过率为93．2％,恢复到原通过率的97．5％．结论：采用超滤法可以脱除大蒜粗多糖中的蛋白质．     

Preparation of rAAV/hFⅨ by HSV/AAV hybrid helper virusand evaluation of its safety

Hemophilia B is a hemorrhagic disease resulting from Factor Ⅸ gene (hFⅨ) mutation as an X-linked recessive inherited trait. The incidence of this disease is 1 in 30000. Clinical treatments depend mainly upon blood transfusions or administration of prothrombin complex so that patients are at the risk of infections with the HIV and hepatitis viruses. Gene therapy offers an attractive alternative in the treatment of hemophilia B by eliminating those risks. In 1991, our lab conducted clinica…     

仙人掌多糖的超滤膜分离提取及其影响因素

应用不同截留分子质量的超滤膜对仙人掌多糖浸提液进行分离、纯化和浓缩,并分析了超滤压力、超滤温度、纯化时间、料液体积流量、浓缩倍数等对超滤过程的影响,得出了最适宜的操作条件.研究结果表明,当选用截留分子质量为10000 ku的超滤膜、超滤压力为0.20MPa、超滤温度为25℃、料液体积流量控制在0.04~0.05 L/min、浓缩倍数为5~7倍时,粗多糖得率达0.95%.与传统的真空浓缩法相比,超滤浓缩法的粗多糖得率较高,所得多糖的品质也得到了改善,减轻了后续工艺进一步分离纯化多糖的负担.     

A novel method for purification of recombinant adenoassociated virus vectors on a large scale

A novel method for recombinant adeno-associated virus (rAAV) purification on large scale is described. The method involves three steps, including chloroform treatment, PEG/NaCl precipitation and chloroform extraction. The whole procedure can be performed in four hours. Using this purification method, we can reproducibly obtain, from 4×10⁹ of proviral cells cultured in roller bottles, purified rAAV-GFP stocks with titers of around 5×10¹³ particles/mL and purity greater than 95%. The infectious titers of the vector stocks were up to 2×10 TU/mL, thus particle-to-infectivity rate was about 25. Under an electronic microscope, most rAAV particles appeared full and a few were in intermediate form. Empty particles were rarely seen. The purified rAAV-GFP stocks have been successfully used in in vitro and in vivo transfection experiments. Therefore, this new method offers a simple, rapid and cost-effective way for large-scale rAAV purification.