MMP—2PEX结构域的最佳表达条件

为研究MMP－2PEX结构域在大肠杆菌BL21（DE3）中的最佳表达条件,直接从构建好的表达载体PET－MMP2 PEX中高效表达MMP－2 PEX结构域蛋白。经SDS－PAGE与软件分析,确定其最佳表达时间为2h,菌液密度值为0．6时,所表达的蛋白含量最高,而IPTG在一定浓度范围内对表达含量不产生影响。     

TNFAIP1基因通过抑制Bcl-2的表达诱导细胞凋亡

将TNFAIP1基因成功克隆到真核表达载体pCMV—Myc中,研究TNFAIP1基因诱导细胞凋亡的机制．Hochest33258和流式细胞计数实验发现,过表达TNFAIP1能够诱导HeLa细胞凋亡．通过对凋亡相关基因的研究,发现过表达TNFAIP1能够抑制Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达,推测TNFAIP1基因可能通过抑制Bcl-2的表达诱导细胞凋亡．     

TNFAIPl基因通过抑制Bcl-2的表达诱导细胞凋亡

将TNFAIPl基凼成功克隆到真核表达载体pCMV-Myc中,研究TNFAIPl基因诱导细胞凋亡的机制.Hoehest33258和流式细胞计数实验发现,过表达TNFAIPl能够诱导HeLa细胞凋亡.通过对凋亡相关基因的研究,发现过表达TNFAIPI能够抑制Bcl-2的mRNA水平和蛋白表达,推测TNFAIP1基因可能通过抑制Bcl-2的表达诱导细胞凋亡.     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

人CYP2D6基因体外表达体系和功能研究方法的建立

根据GeneBank数据库中人CYP2D6基因构建表达载体pMA91-CYP2D6,转化酵母细胞AH22在体外进行表达,抽提所表达的CYP2D6微粒体蛋白进行Western Blot验证表明表达成功.该微粒体蛋白与探针药物异喹胍反应,利用HPLC检测生成产物4-羟基异喹胍,通过分析其得到酶动力学参数K m=10.14±0.94μmol/L,最终建立起完整的人CYP2D6表达体系和功能研究方法,为未来测定CYP2D6各等位基因对应酶的活性,实现临床个性化用药奠定基础.     

CRISPRi技术沉默MRP1基因表达增强A549/DDP细胞对TSN的敏感性

利用CRISPRi技术构建靶向MRP1的干扰载体,采用生物信息学分析MRP1的启动子序列,设计并合成3对sgRNA干扰片段,构建3种靶向MRP1的干扰表达载体,分别转染A549和A549/DDP细胞后,通过q RT-PCR和Western blot方法检测MRP1 mRNA和蛋白的表达情况,MTT法检测细胞对川楝素的敏感性,激光共聚焦显微镜下观察细胞的形态学变化．结果表明,基因测序证实成功构建了3种干扰载体,分别转染干扰载体至A549/DDP细胞48 h后MRP1 RNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）,其中sgRNA-MRP1-2干扰效果最好;将sgRNA-MRP1-2转染并使用60 nmol/L川楝素处理后,细胞对川楝素的敏感性显著增加,IC50值显著降低（P<0.01）,细胞形态由梭形变为椭圆形,染色质高度凝聚、边缘化．     

杀虫球孢白僵菌菌株筛选及类枯草杆菌蛋白酶基因的克隆

在水稻叶蝉僵虫中分离出一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana),根据GenBank上球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因序列同源性设计引物,采用RT-PCR法得到一个球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cD-NA片段.利用表达载体pET28a( ),在大肠杆菌中表达了CDEP2蛋白.     

P185c—erBb—2胞外区结构域在大肠杆菌BL21中的表达分析

以PET－HT为表达载体,探讨在大肠杆菌BL21中高效表达P185c-erBb-2胞外区结构域蛋白的最佳条件,经SDS－PAGE与软件分析,确定其最佳表面时间为3h,当菌液密度为0．7时,所表达的蛋白含量最高,而PTG在一定浓度范围内对表达含量不产生影响。     

利用靶拟态合成和Gateway技术构建水稻miR164c沉默突变体

以水稻基因组DNA为模板,PCR扩增得到与miR399互补的Os MIM399后,改造成与miR164c互补的靶拟态序列Os MIM164c,经测序分析后连入p GWC载体,获得入门载体p GWC-Os MIM164c;利用Gateway技术,将入门载体p GWC-Os MIM164c经LR反应连接到植物表达载体GCS中,获得GCS-Os MIM164c表达载体,经农杆菌介导将该表达载体导入水稻品种Kasalath的愈伤组织中,组织培养后获得再生植株并进行目的基因的PCR鉴定,Real Time PCR方法检测阳性突变体植株中miR164c的表达量.研究结果表明,miR164c在突变体植株中的表达量显著低于野生型,说明miR164c沉默突变体构建成功.     

两种内插法在运动补偿视频编码中的比较

一些混合视频编码标准都是基于运动补偿预测的．为了进行运动补偿，运用了小数像素的运动矢量；为了估计和补偿小数像素的偏移量，必须对图像信号进行内插．通过对目前使用最普遍和最简单的图像信号双线性内插法与近期H．26L提出的图像信号立方卷积内插法进行理论分析与比较，得出两种内插方法各自的优缺点，并通过实验对分析结果进行了验证．     

羊草(Leymus chinensis)psbD基因开放读码框(ORF)的克隆及序列分析

从羊草中提取总RNA,采用简并PCR方法,扩增出编码353个氨基酸的psbD基因开放读码框(Open read ing frame,ORF)cDNA序列,GenBank登陆号为FJ176573,并对其序列进行了分析.同时次基因组DNA为模板对psbD基因开放读码框区域进行了扩增,证明该基因无内含子,为其功能的进一步研究提供基因材料和理论依据.     

基因弹性研究

以生物信息论的观点研究了基因弹性,定义了基因弹性等概念,提出了基因弹性系数表达与测定方法,并用水稻穗部性状受播期影响而获得的试验结果进行了演示.     

导入额外拷贝dctA基因的根瘤菌工程菌株的构建

为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重组表达载体。利用三亲本杂交技术将表达载体转入费氏中华根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。研究表明,转基因工程菌株侵染大豆幼苗后与出发菌相比,固氮酶活性有了显著提高,为提高大豆产量的研究提供一定参考。     

拟南芥FIE基因特异片段的克隆及序列测定

根据拟南芥FIE基因的序列设计PCR引物,以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增FIE基因特异性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为1633bp,与预期结果相符。将该基因片段定向克隆到pGEM-T载体上,得到重组质粒p1633,酶切鉴定及测序分析结果表明该克隆为拟南芥FIE基因特异片段,与拟南芥FIE基因比较同源性达99.8％,可以作为探针使用。     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

人角质细胞生长因子-1在水稻中的表达

人角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor,KGF）在组织的损伤修复中起着重要的作用.植物细胞生物反应器是一种成本低、安全性好的蛋白生产系统.本研究将人KGF-1经农杆菌介导法转入水稻中,共获得38株抗性再生植株.Southern杂交和RT-PCR结果表明KGF-1基因整合入水稻基因组中且部分转化株中KGF-1基因得到转录.Western blotting检测结果显示有两株转化水稻中能够表达KGF-1.     

一个与鸭繁殖性能相关卵巢差异表达基因的分离分析

本文用mRNA差异表达显示技术,分离分析了繁殖准备期金定鸭（Anas platyrhynchos domesticus）和绿头野鸭（Anas platyrhynchos）卵巢差异表达基因.通过卵巢组织RNA提取、反转录、mRNA差异显示PCR扩增、PAGE和银染检测扩增产物、差异带回收纯化、T载体连接转化和克隆测序分析,获得一个可能与鸭繁殖性能有关的卵巢差异表达基因片段,片段大小882bp.同源性分析表明,其序列与发情期羊卵巢cDNA（同源性为96%）、褐家鼠睾丸cDNA（同源性为83%）有很高的同源性.基因家族摸体分析表明,该序列的部分片段分别与Sox-5基因、转录因子USF基因、性别决定因子SRY、Cdx A基因都有90%以上的同源性典型摸体.由上述分析,我们推测该cDNA片段与鸭繁殖性状有关.     

基因枪法导入cyclAt和GUS基因获得转基因水稻

以cyclAt基因为目的基因,HPT和GUS为选择和报告基因,应用PDS-1 000/He型基因枪协同转导,通过轰击来源于水稻成熟种子诱导产生的胚性愈伤组织,获得了转基因水稻植株.结果表明:通过X-Gluc染色分析,GUS基因在愈伤组织和再生植株叶片中的表达效率高.以转基因植株的基因组DNA为模板,用cyclAt基因的特异性引物对其进行PCR扩增,只检测到1 000 bp左右的片段,比其1 604 bp的完整序列小,因此推测cyc1At基因在转导入水稻后被剪接.此外,在协同转导过程中,cyc1At和GUS可能与受体基因组DNA随机整合,因此视GUS基因为报告基因有一定局限性;但两者同时被整合的频率远高于单一基因的整合.     

花粉管通道法转柱头外露棉DNA及转化体RAPD分析

提取“异9-3”柱头外露棉总基因组DNA，通过花粉管通道法经微量注射导入抗虫棉707．1的胚囊内，D1代田间筛选到柱头外露的转化植株，遗传分析结果表明转化株柱头外露性状由一对隐性基因控制，50个随机引物进行PCR扩增，33个引物扩增出的DNA在供体、受体和转化体之间呈现出多态性，其中引物S462(TCG GCA CGC A)在供体和转化体之间出现相同产物而受体没有出现扩增产物，该引物有可能作为柱头外露系的分子标记．RAPD分析结果表明转化体与受体有较多相同基因位点，而与供体相同基因位点较少，转化体还有供体和受体都不具有的基因位点，这可能是外源DNA导入时引起碱基突变所致。