牦牛肥胖基因和肿瘤坏死因子α基因的序列分析

肥胖基因(ob gene)是近年来刚被克隆的新基因，该基因的表达产物瘦蛋白(Leptin)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能．肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种主要由活化单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生的多效性细胞因子，时TNF-α基因的基础及应用研究已成为近年来动物抗病育种的研究热点之一，本文克隆及测序分析了牦牛上述两个基因的部分片段。结果表明：ob基因大小为1773bp，TNF-α基因为1160bp，通过genebank中的blastn比较分析牦牛ob基因和TNF—α基因与普通牛种的相应基因同源性都高达98％。     

人亲环素基因的克隆、表达及应用研究

亲环素(CyP)具有多种生物学功能,它是CsA的胞内受体,能和CsA特异结合;它又是人类免疫缺陷病毒(HIV)在细胞内复制的必要因子.研究首先从动物组织中提取、纯化CyP蛋白,并且克隆了CyPA基因,在Ecoli中获得高效表达.进而又克隆、表达了CyPB基因,进行了生物学活性测定,制备了CyP蛋白单克隆抗体和多抗,建立了多项检测方法.研制的CyP自身抗体及CsA血药浓度两种检测药盒已在临床应用,已取得良好的效益.     

人纤溶酶原Kringle 1基因的克隆与表达

从人肝组织中抽提总RNA，通过RT-PCR方法扩增出人纤溶酶原（plasminogen)Kringle 1片段，构建pPIC9K-K1载体，电击转化酵母，成功获得pPIC9K-K1/GS115工程菌，摇瓶发酵初步结果表明，工程菌能稳定表达可溶性的重组K1蛋白，分子量为15kd，发酵液中的蛋白含量为84.17mg/L。     

鳜鱼肥胖基因的克隆与组织表达

为了研究脊椎动物肥胖基因(obese gene, ob)结构与功能关系,利用PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肥胖基因全长序列:鳜鱼ob基因全长1 398 bp, 由2个外显子和1个内含子构成,其完整的开放阅读框由486 bp组成,编码161个氨基酸. 应用Genome Walker方法克隆得到一段长为357 bp的鳜鱼ob基因5′侧翼区序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件. 我们将克隆得到的鳜鱼ob基因编码氨基酸序列leptin与其他物种leptin序列分别进行同源性比较,并构建系统进化树,发现虽然不同物种间leptin序列差异非常大,但进化树分析显示所有的leptin序列,包括哺乳动物、两栖动物和真骨鱼类,各自聚集成簇. 最后通过荧光实时定量PCR方法研究鳜鱼不同组织ob基因的表达水平,与哺乳动物ob基因主要在脂肪组织表达分布不同,鳜鱼ob基因在所有被检测组织中均有表达,在肝脏组织中大量表达,其次是脑,在肠道、脂肪、脾和肌肉中只有微量表达,说明鱼类ob基因的表达分布及其调控机制可能与哺乳动物存在差别.     

人基质细胞中新基因的获得及目的基因的克隆

取连续培养的骨髓基质细胞并提取其mRNA,合成cDNA后,收集＞400bp的片段,连接到真核表达载体pcDNA3.0上,构建人胎儿骨髓基质细胞真核cDNA质粒文库,并以PCR的方法从文库中扩增出编码人IL－6、SCF的基因序列,随机对文库克隆进行测序,得到了3个新基因EST,其中2个在GenBank的登录号分别为AF244998及AF244999。     

人Megalin基因四个结构域的cDNA克隆

以人肾脏组织cDNA为模板,用PCR技术克隆了编码人Megalin基因四个结构域的cDNA,并对其进行了测序.结果表明,编码人Megalin基因四个结构域的cDNA长度分别为863bp、1,008 bp、1,247 bp及1,359 bp.编码第一结构域的cDNA序列与GenBank报道的序列有99.9%的同源性,其中两个位点有差异(第457位和605位分别为C和G,而非G和A);其余三个结构域对应的基因序列与GenBank报道的序列完全相同.     

拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子，通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码，包括3个成员：CBF1、CBF2和CBF3，在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列，设计了一对PCR引物，用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。     

人野生型抑癌基因PTEN的逆转录PCR法克隆及序列分析

以正常人胎盘组织总RNA为模板，通过优化引物和PCR条件，采用逆转录PCR法扩增出人野生型PTEN基因cDNA片段，并克隆到pMD18-T载体，获得重组子pMD-PTEN．序列分析表明，该cDNA长1212 bp，与GenBank中PTEN基因序列相比有3个碱基发生了变化，但全部为同义突变，证实获得了人野生型抑癌基因PTEN的cDNA克隆，为进一步构建原核表达载体及研究PTEN蛋白的抑癌效果、抑癌机理打下基础．     

人血管生长素基因的化学合成与克隆

采用固相亚磷酸胺法化学合成并克隆人血管生长素基因，该基因全长４２３ｂｐ，其中３６９ｂｐ的结构基因全部选用大肠杆菌偏爱的密码子，在结构基因上游设置了适合原核非融合蛋白表达的核糖体结合位点的Ｓ－Ｄ序列。采用两级退火一步拼接法成功克隆全长基因，该基因适合在多种融合或非融合原核表达载体中表达。     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

日本血吸虫体壁抗原基因的筛选与克隆

为筛选并克隆新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)候选抗原基因,以日本血吸虫成虫总DNA为模板,通过生物信息学以及分子生物学手段从日本血吸虫全基因组中筛选目的基因.根据所筛选到的目的基因的核酸序列设计合成引物,用PCR法扩增目的基因,将其克隆入pBS-T载体后转入到大肠杆菌DH5a菌株,筛选阳性克隆.通过对阳性菌落质粒进行PcR予以证实.最终成功筛选并克隆到日本血吸虫体壁候选抗原基因.     

Expression detection and partial cloning of porcine leptin receptor (OBR) gene

The product of the obesity gene, called leptin, is an important regulator of adiposity, which mainly functions via its regulation of feed intake and energy metabolism. Both obesity gene (ob gene) and leptin receptor gene ( OBR gene) are thought to play a major role in controlling of body fat mass as well as body weight. The result of RT-PCR shows that levels of pig OBRmRNA are higher in hypothalamus, lung and liver, and lower expression can be detected in other tissues. Total RNA purified from 11 different organs and tissues have been hybridized with pig OBR cDNA probes. The hybridization signals are shown in 7 organs and tissues. 4.1 and 3.8 kb bands were observed from hypothalamus, whereas 3.8 and 3.5 kb bands were observed in other tissues instead. The nearly complete sequence of the extracellular domain of pig OBR gene was obtained. The homology of sequence is 89.2% between pig and human, 80.3% between pig and mouse. Alignment of the predicted amino acid sequence of OBR in pig, human and mouse shows that the overall identity is 86.5% between pig and human, 76.6% between pig and mouse. Two WSXWS motifs were found at aa₃₁₃ and aa₆₁₆.     

胚胎性横纹肌肉瘤中下调表达基因HumCyr61的分？…

分离和克隆胚胎性横纹肌肉瘤中下调表达基因ＨｕｍＣｙｒ６１。方法：利用计算机辅助的同源扩增策略，成功克隆一个长１８８７ｂｐ ｃＤＮＡ，并与ＧｅｎＢａｎｋ核酸数据库比较。结果：该基因与鼠生长因子诱导早期表达的Ｃｙｒ６１基因同源度为８２％，在蛋白质水平上的同源度高达９２％，其中对高级结构有重大贡献的半胱氨酸和脯氨酸等氨基酸残基高度保守。查新结果还显示，它包括在胚胎性横纹肌肉瘤细胞系ＲＤ中表达呈下调表达的     

人表皮生长因子（hEGF）基因合成及在枯草杆菌BS9920中分泌表达

采用PCR技术人工合成了一段长约175bp的人表生长因子（hEGF)的基因片段，为了便于克隆，在该片段的5′端设计了Pst I的酶切位点及与pUS186载体signal sequence相连接的碱基部分，在3′端设计了HindⅢ的酶切位点及终止密码子，经DNA分析，合成的片段与已发表的hEGF在序列上完全一致，之后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体pUS186上，构建重组载体pUSE并转化一株枯草杆菌突变菌株BS9920感受态细胞，以PCR法快速筛选重组菌落，RIA检测结果表明BS9920阳性转化子能够表达和分泌hEGF。     

Cloning of a novel gene associated with human nasopharyngeal carcinoma

One EST N27741 with high expression in normal adult nasopharynx tissues but low expression in adult poorly differentiated squamous nasopharyngeal carcinoma has been selected out by the high-density cDNA array expression profiling technique. The differential expression has been confirmed by RT-PCR. One novel gene of 1096 bp has been cloned based on this EST. Bioinformatics analysis found that the new gene sequence contains a whole reading frame encoding 256 amino acids. There is a stop codon TAA in front of the 5′ end start codon, and a tailing signal AATAAA and poly A tail at the 3′ end. There is no homologous known gene found after searching by blasting this sequence to non-redundancy nucleotide database. Therefore it is considered a novel gene related to nasopharyngeal carcinoma.     

杨小舟蛾MtroOBP1基因的克隆、序列分析及表达

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是一种嗅觉相关的蛋白,该蛋白参与大多数气味分子的识别过程,并与气味分子相结合。获得杨小舟蛾[Micromelalopha troglodyta (Graeser)]OBPs以明确其特性。【方法】选择羽化后健康的杨小舟蛾触角为模板,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆杨小舟蛾MtroOBP1基因,利用生物信息学分析软件研究其基因序列和蛋白结构,运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术研究MtroOBP1的组织表达模式。【结果】利用RT-PCR技术从杨小舟蛾触角总RNA中扩增得到MtroOBP1基因(GenBank登录号:MN056510),序列分析表明,MtroOBP1开放阅读框为777 bp,一共编码了258个氨基酸残基,且翻译的氨基酸序列仅含有4个保守的半胱氨酸位点,表明得到的OBP基因的编码蛋白不属于典型气味结合蛋白家族,而是属于Minus-C家族。蛋白质理化性质预测显示:MtroOBP1蛋白的分子量为29 664.57 u,等电点为6.23,有18个潜在的磷酸化位点,没有明显的跨膜区,疏水指数为-2.011~3.078,有一个由19个氨基酸组成的信号肽,说明为分泌型蛋白。组织表达模式表明MtroOBP1在杨小舟蛾的各部位都表达,但在触角中表达量最高。【结论】首次克隆得到杨小舟蛾MtroOBP1基因,在触角中高表达,推测其蛋白具有运输气味分子的功能,在杨小舟蛾的嗅觉识别中起着至关重要的作用。     

人胰岛素A链与B链基因的化学合成,克隆与表达

采用大肠杆菌密码子，用化学法分别合成人胰岛素２１个氨基酸的Ａ链，３０个氨基酸的Ｂ链，并在基因的５端引入甲硫氨酸密码子，尾部加入终止密码，两端加入限制性内切酶，Ａ链为８３个核苷酸，Ｂ链为１１０个核苷酸，经纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接反应后，分别克隆了人胰岛素Ａ、Ｂ链基因，然后选用ＰＬ启动子，构建了以牛生长前１３４个氨基酸的大片段基因，分别与人胰岛素Ａ链、Ｂ链基因的融合基因的融合基因的表达质粒ＰＬＷ