纳米谷氨酸壳聚糖制备及其体外质粒转染研究

采用表面修饰方法制备出谷氨酸修饰的壳聚糖纳米基因载体。对样品进行红外分析、粒度分析、zeta电位分析、生物相容性、凝胶阻滞分析、DNA保护性试验、体外细胞转染研究。结果显示所制得的谷氨酸修饰的壳聚糖纳米颗粒平均粒径为170nm,其zeta电位为 4.7mV。红外分析显示谷氨酸已通过酰胺键结合在壳聚糖上。MTT实验结果显示纳米颗粒与细胞有良好的生物相容性。凝胶阻滞分析和DNA保护试验结果表明纳米载体可与DNA通过电性结合作用而结合,并可以有效保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用。而体外细胞转染的结果表明,谷氨酸修饰的纳米粒能介导pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白。因此,谷氨酸修饰的壳聚糖纳米颗粒可作为一种新型非病毒基因载体介导核酸类生物大分子进入细胞内。     

氧化亚铜／壳聚糖纳米复合材料的制备及复合机制研究

采用沉淀析出法,通过加入去溶剂化试剂硫酸钠来制备壳聚糖纳米粒子．通过电化学沉积法制备了氧化亚铜／壳聚糖纳米复合材料．随着反应条件的改变,氧化亚铜能够在壳聚糖纳米颗粒上形成针状或球形氧化亚铜等不同形貌．这种复合材料通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）等表征方法得以证实．并借助傅立叶变换红外光谱（FT-IR）技术对氧化亚铜与壳聚糖纳米颗粒之间-NH2和-OH的化学结合作用进行了探讨．     

羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的制备与表征

采用共沉淀法制备纳米四氧化三铁磁性粒子，通过一步包埋法将四氧化三铁磁性纳米粒子用羧甲基壳聚糖进行直接包覆，制备羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物。透射电镜观察表明：该磁性纳米复合物呈球状，平均粒径为11．6nm；Zeta电位和粒度分析结果表明：其粒度分布比较窄，平均粒径约为12nm，与电镜观察结果一致；红外光谱和热分析结果表明：Fe3O4表面成功地包覆了羧甲基壳聚糖。将该磁性纳米复合物应用于鸡血细胞基因组DNA的分离，结果表明：该磁性纳米复合物非常适合于基因组DNA的分离纯化，避免了传统苯酚一氯仿法中有毒试剂的使用，能够显著简化整个DNA的纯化制备过程。     

壳聚糖-卵透明带DNA纳米微囊的制备及其体外表达

目的：发展壳聚糖-卵透明带口服DNA粘膜免疫避孕疫苗。方法：首先利用基因工程技术构建含卵透明带特异抗原pZP3α DNA的真核质粒表达载体pVAX1-pZP3α，然后用壳聚糖C390包被pVAX1-pZP3α重组质粒制备免疫微囊，测定免疫微囊对质粒DNA的包裹率，用原子力显微镜(AFM)观察壳聚糖-DNA微囊的形态结构，并体外转染HeLa细胞，用间接免疫荧光法(IIF)检测pZP3α的瞬时表达。结果：pZP30αDNA正确插入到载体pVAX1中并与壳聚糖C390形成纳米免疫微囊，对重组质粒pVAX1-pZP3a的包裹率达90％以上，AFM成像技术显示这些微囊的直径为100nm到300nm不等，平均为224.6nm，形状为球形、椭圆形等。体外转染HeLa细胞用IIF法检测到了抗原pZP3α在细胞内的表达。结论：壳聚糖-卵透明带口服DNA纳米免疫微囊制备成功，为进一步发展更安全、方便、有效的卵透明带DNA避孕疫苗打下了基础。     

拓扑DNA在壳聚糖纳米粒子中的固定化负载

为了体外固定化不稳定单链拓扑DNA,采用阴阳离子共聚法制备壳聚糖/拓扑DNA复合纳米粒子,并进行傅立叶变换红外光谱、粒径/zeta电位和透射电子显微镜等分析表征。结果显示,纳米粒子中DNA上磷酸基团振动峰显著减弱,高温制备样品中双链DNA含量少于低温样品,表明DNA的不稳定单链结构获得了体外固定化;同时,伴随DNA单链比例升高,复合纳米粒子的平均水合粒径由573.9 nm降到205 nm,zeta电位由19.53 mV降到9.75 mV,复合纳米粒子结构由核壳结构转变为实心胶束结构。几种差异结构壳聚糖/DNA纳米粒子的成功制备,可为后续生物活性或载药研究提供良好的技术支持。     

超声场下不同形貌银胶体的制备与表征

为了研究制备工艺条件对不同形貌银胶体稳定性的影响,在超声场作用下,以AgNO3为前驱物,聚乙烯吡咯烷酮为保护剂,KBH4和N2H4·H2O分别为还原剂,制备了稳定的银胶体,并利用透射电镜和分光光度技术对制备的银胶体进行了表征．结果表明,超声场分布、超声作用时间、超声功率和还原剂种类等对银纳米粒子形貌影响较大．未经超声处理的银胶粒为较大的类球形和六边形,随着超声作用时间和超声功率的增加,颗粒变小．驻波场下制备的银颗粒具有一定的生长取向,有利于类球形和六边形银纳米颗粒的形成,而在扩散场中得到单分散的球形银纳米颗粒．经超声场处理的银胶体稳定性增强,主要以单分散的球形纳米颗粒存在,平均粒径约为20 nm,放置数周后未出现聚沉物．改变还原剂的种类,可制备出球形、类球形和六角形银纳米颗粒．     

庆大霉素/水杨酸/壳聚糖复方纳米粒的制备及体外释放

通过壳聚糖与三聚磷酸钠的离子交联作用制备了具有拮抗庆大霉素耳毒性功效的庆大霉素/水杨酸复方壳聚糖纳米粒。用紫外分光光度计、纳米粒度仪和Zeta电位仪、透射电子显微镜、扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪和X射线衍射仪等考察了壳聚糖纳米粒的粒径、zeta电位、形态、载药能力及体外释放行为。结果显示复方纳米粒为球形,平均粒径为40 nm;庆大霉素与水杨酸的包封率分别为(91.24±0.24)%和(80.75±0.15)%,载药量分别为(34.15±1.02)%和(38.35±0.48)%;在体外释放试验中,庆     

新型纳米复合材料作为非病毒基因载体的研究

为了制备理想的非病毒基因载体,合成了甲壳三糖-g-壳聚糖(TCS),并与钙基累托石(REC)插层复合制备纳米复合材料,采用X射线衍射和透射电镜方法对产物进行了表征,考察了其细胞相容性,将REC、TCS和纳米复合材料分别与质粒DNA复合形成复合物,并考察了其体外基因转染效果.结果表明:TCS、REC及纳米复合材料的细胞相容性良好,当N/P比为3时,TCS/DNA复合物粒径大小都在75 nm左右,REC加入后,其粒径不同程度地增大,最大达到191 nm;相对分子质量高的TCS所得DNA复合物较相对分子质量低的TCS所得DNA复合物稳定,而REC的加入降低了TCS/DNA复合物的稳定性;TCS/REC-DNA复合物能介入肝癌细胞中并表达荧光.说明该纳米复合材料可作为潜在的非病毒基因载体.     

无机硅壳类纳米颗粒对细胞的毒性检测

采用MTT分析方法结合激光共聚焦荧光显微成像系统研究了无机硅壳类纳米颗粒，包括无机二氧化硅纳米颗粒（SiNP）、二氧化硅壳荧光纳米颗粒（FSiNP）以及二氧化硅磁性纳米颗粒（MSiNP）对COS－7细胞、HNE1细胞和MCF－7细胞的毒性。研究结果表明：在有效浓度范围内，无机硅壳类纳米颗粒具有很好的生物相容性，对细胞的生长和代谢没有明显的影响，从而为无机二氧化硅纳米颗粒在生物医学中的应用提供了坚实的理论依据。     

纳米CeO2粉体发光性能的研究

采用草酸沉淀法制备了纳米CeO2粉体,通过XRD、TEM等测试手段对其进行了结构表征和形貌分析;应用荧光光谱法对样品的发光性能进行了测试;探讨了纳米CeO2粉体的发光机理以及热处理温度对其发光性能的影响．结果表明,实验所得的纳米CeO2为立方萤石结构,其颗粒尺寸约为20-30nm,形貌接近于球形．纳米CeO2粉体具有良好的紫蓝色发光性能,主要是Ce4f→O2p跃迁和缺陷能级→O2p跃迁共同作用的结果,其发光强度随热处理温度的升高而增强．     

紫花苜蓿转录因子MsDREB1基因表达产物的亚细胞定位

利用生物信息学方法对紫花苜蓿MsDREBl进行了生物信息学分析．结果表明,该序列舍有AP2典型结构域,在N端存在核定位信号．为进一步验证该基因功能,构建MsDREBl与绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP）基因融合的植物表达载体pCAMBIAl302-MsDREBl,再利用基因枪将其转入洋葱表皮细胞,在共聚焦扫描显微镜下观察MsDREBl基因表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位．结果表明,MsDREBl基因表达产物定位于细胞核中,符合DREB家族转录因子特性．     

根癌农杆菌介导的GFP在洋葱表皮细胞定位研究

采用根癌农杆菌介导的方法,以受控于CaMV35S启动子的携带有GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1300-35S-GFP转化洋葱表皮细胞.荧光显微镜下观察结果显示,GFP基因在经浸染和共培养后的洋葱表皮细胞中得到了表达,绿色荧光分布在细胞核和细胞质中,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础.     

用于基因疫苗接种的气动式基因枪

为解决现有各种基因枪在微弹制备方面存在的问题并减小冲击波影响,提出一种基因枪结构。将裹着基因疫苗的微弹吸附在不锈钢网上,并将不锈钢网放置在加速通道中加速微弹。在数值模拟的基础上,研制了实验装置,测试了装置的性能,并利用该装置将pEGFG质粒导入H e la细胞。实验结果表明:这种结构的基因枪在0.3M Pa的气压下就可以把微弹加速到300m/s以上,且微弹在靶面分布均匀;射入H e la细胞的pEGFG质粒也得到了表达,能满足基因疫苗接种的要求。     

抗除草剂旱稻转基因植株的获得

以旱稻丹粳旱５－５５、６－２４、６－３７的悬浮细胞及未成熟胚为受体材料，采用基因枪法将含ＢＡＲ基因的ｐＤＭ３０２质粒ＤＮＡ导入旱稻细胞中，经ＰＰＴ筛选获得抗性愈伤组织，筛选出的愈伤组织在分化培养基上再生出完整的旱稻转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交分析表明，外源ＢＡＲ基因已整合到水稻基因组内，抗除草剂试验结果表明，转化植株对０．０１％Ｂａｓｔａ（有效成分为ＰＰＴ）有一定程度的抗性，说明外源ＢＡＲ     

bar基因表达框和完整质粒转化对水稻农艺性状的变异效应比较

通过分析转基因植株的株高、分蘖数、结实率、千粒重四个主要农艺性状的变异,比较基因枪法转化的基因表达框(仅含启动子、基因开放阅读框和终止子序列)和完整质粒两种基因载体形式对水稻农艺性状的变异效应.结果表明,与非转基因亲本相比,转基因植株的千粒重和分蘖数与对照无显著差异;株高变异也不大,17个转基因株系中,仅基因表达框转化的2个株系XFb-36和XFb-63株高变矮;而结实率变异最大,有9个转基因株系结实率显著降低,变异率达50%以上.总体上看,基因表达框和完整质粒两种基因载体形式对水稻农艺性状的变异效应差异不明显,基因枪转化对水稻农艺性状的变异效应主要表现为降低植株的育性,转基因水稻植株的农艺性状变异主要来源于转基因过程中组织培养引起的无性系变异.     

添加纳米粒子对脂肪酶交联酶聚集体活性及结构的影响

将纳米TiO2、纳米MgO和纳米Cu分别引入假丝酵母脂肪酶（Candida sp. 1619）的交联酶聚集体（CLEAs）制备过程，获得相应的纳米粒子-CLEAs，采用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度分析仪(SLP)等分析了纳米粒子对CLEAs活性和结构的影响。结果表明与未加纳米粒子的CLEAs相比，适量纳米TiO2的加入可提高CLEAs的酶活，最大增加15.2%；而不管添加浓度大小，纳米MgO、纳米Cu对CLEAs酶活均有抑制作用，酶活下降63.7%~97.9%。SEM、SLP分析结果表明，与未添加纳米粒子时相比，加入纳米TiO2的CLEAs粒径变小，粒度较均匀，孔道增加；而纳米MgO-CLEAs和纳米Cu-CLEAs则出现粒度不均匀性增加、粒径范围扩大、孔道减少的现象。FTIR分析结果表明，加入3种纳米粒子后CLEAs二级结构中有序结构（α-螺旋、β-折叠）/无序结构（β-转角、无规则卷曲）值显著提高，顺序为纳米TiO2-CLEAs（0.55）>纳米MgO-CLEAs（0.43）>纳米Cu-CLEAs（0.35）>CLEAs（0.28），这与纳米粒子-CLEAs酶活顺序不一致，表明纳米粒子可能还存在其他影响CLEAs酶活的途径。     

Effect of HS2 and HS3 elements on erythroid-specific expression in transgenic mice

The expression plasmids CMV/GFP, HS2ALL, HS3ALL and HS23ALL were selected to investigate the effect of HS2 and HS3 element on erythroid-specific expression in transgenic mice. These plasmids were digested with restriction enzymes and purified. And five DNA fragments, CMV/GFP, HS2/GFP, CMV/HS2/GFP, HS23/GFP and HS3/GFP were obtained. After purification, the above DNA fragments were microinjected into the pre-nuclei of the mice fertilized eggs and transgenic mice were generated, with an integration rate of 10.89%. The green fluorescence protein(GFP) expression in many transgenic mouse tissues was determined by FACS analysis. The results showed that the HS2 and 1.7 kb of β-globin gene promoter were sufficient for the erythroid-specific expression of β-globin gene. The GFP expression of different recombinant constructs was also analyzed in blood of all the transgenic mice with FACS. The results indicated that HS2 and HS3 had the same enhancement activity on the regulation of β-globin gene expression. Moreover, these two elements showed a significant synergistic effect on gene expression at the transgenic mouse level, although the GFP expression varied largely among different transgenic mouse litters.     

绿色荧光蛋白基因转化大岩桐的研究

利用农杆菌介导法 ,用含有绿色荧光蛋白基因的二元双价表达载体pBINm -gfp5 -ER转化大岩桐 ,并得到卡那霉素 (Kanamycin ,Kan)抗性再生植株 .对其进行初步PCR检测 ,结果表明 ,K2 0 0 (含Kan 2 0 0mg/L)培养基上的绿苗中有 3株PCR结果呈阳性 .对PCR阳性的植株进行了点杂交分析 ,均表现出较强的杂交信号 ,这说明外源基因已整合转入到大岩桐基因组中 .在荧光显微镜下观察转基因大岩桐 ,发现部分花、叶细胞均发出一定强度的绿色荧光     

用基因枪法将AGP基因导入水稻的初步研究

以水稻成熟种子的愈伤组织为受体，采用基因枪法将AGP基因导入水稻细胞，通过组织培养和抗性筛选，得到了转基因植株，转基因植株总DNA的PCR分析初步表明，目的基因已整合到水稻的基因组中。     

Expression of hepatitis B surface antigen gene (HBsAg) in Laminaria japonica (Laminariales, Phaeophyta)

A transformation model for Laminaria japonica was established from 1993 to 1998, on the basis of which the transgenic kelp with heterologous gene encoding hepatitis B surface antigen (HBsAg) was obtained by using the micro- particle bombardment transformation method. Results of quantitative ELISA showed that HBsAg in transgenic kelp was 0.529 μg/mg soluble proteins on average and the highest value was 2.497 μg/mg, implying that recombinant HBsAg had natural epitope. Further support for the integration of HBsAg gene into kelp genome was obtained by PCR- Southern and total DNA hybridization. Prospect of kelp bioreactor producing high value materials such as edible HBV vaccine was discussed as well.