细粒棘球绦虫新疆株胆汁酸钠协同转运蛋白基因的克隆及序列分析

 从新疆株细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)原头蚴中克隆胆汁酸钠协同转运蛋白(sodium-bile acid co-transporter,EgSBACT)基因,进行序列测定和生物信息学分析。首先设计EgSBACT 基因特异性引物,用RT 及PCR 方法从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴提取总RNA,将其反转录成cDNA 后扩增EgSBACT 基因并将其克隆至原核表达载体pET30a 中,测序鉴定序列并进行生物信息学分析。结果显示,RT-PCR 扩增出一长度约650 bp 的基因,测序显示其长度为654 bp,序列与Gen-bank 公布的EUB59978.1 完全一致,其编码217 个氨基酸,预测其等电点为9.28。同源性分析发现,EgSBACT 蛋白序列与中华枝睾吸虫SBACT(GenBank:GAA57409.1)同源性最高,达到43%。进化树分析表明,细粒棘球绦虫的SBACT 蛋白与吸虫纲的SBACT 相聚集,在进化树上处于一枝,而与其他物种亲缘性较远。由此表明,本研究成功克隆出细粒棘球绦虫EgSBACT 基因。     

人体和绵羊细粒棘球蚴病原生物学的比较研究

细粒棘球蚴是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的幼虫,主要寄生于人体和牛、马、羊、猪、骆驼等家畜以及多种野生有啼动物的内脏,发生棘球蚴病,成为世界上一个公共卫生的重要问题。成虫寄生于狗、狼、豺、狐等多种食肉兽的消化道内,为世界性的分布。由于宿主和地理因素的影响,虫体往往产生个体或种内形态学的变异,     

青海省称多县野生狐狸棘球绦虫CO Ⅰ基因多态性分析

为进一步了解野生狐狸在棘球属绦虫感染传播的情况,搜集并解剖野生狐狸6只,对搜集的其中4株多房棘球绦虫、2株石渠棘球绦虫的线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶第1亚基（COⅠ）基因进行同源性分析.结果显示：6只野生狐狸中有2只感染多房棘球绦虫,感染强度分别为1640和839,1只感染石渠棘球绦虫,感染强度为833;线粒体DNA CO Ⅰ基因扩增得到了363 bp的目标片段,其中4株多房棘球绦虫与GenBank中检索到的基因序列（AB461417）一致性达到100％,2株石渠棘球绦虫的mtDNA CO Ⅰ基因序列与GenBank中检索到的基因序列（AB159136）一致性达到99.2％,有3处碱基置换位点.称多县野生狐狸肠道内寄生着棘球属绦虫,对其防控研究应该引起重视.     

四川黑山羊品种(群体)的RAPD标记研究

从5组24个随机引物中筛选出16个重复性好的多态引物,对四川9个黑山羊品种(群体)共计572只个体,进行随机扩增多态DNA(RAPD)标记研究.结果表明,16个引物扩增出125条带,其中102条带呈现多态,多态率为81.61%.不同引物扩增出的DNA片段在各品种(群体)中的分布频率不同.9个黑山羊品种(群体)间相似系数为0.7533～0.9642,遗传距离指数为0.0358～0.2467.引物OPQ-06(序列为GAGCGCCTTG)未在乐至黑山羊中扩增出900bpDNA片段,而在其他8个黑山羊品种(群体)中出现率均为1,可作为区分乐至黑山羊和其他8个黑山羊品种(群体)的分子遗传标记.引物OPK-03(序列为CCAGCTTAGG)未在江安黑山羊扩增出550bpDNA片段,在其他8个黑山羊品种(群体)中出现率均为1,可用于区分江安黑山羊和其他8个黑山羊品种(群体)的分子遗传标记.     

多频聚焦超声波对细粒棘球蚴囊壁药物通透性的影响

将人工接种感染的小鼠腹腔细粒棘球蚴包囊90个,随机分为A~E 5组,分别用多频聚焦超声不同功率和组合方式进行超声照射.多频聚焦超声辐照后的各组包囊置于含1 00μg/mL阿苯达唑的RPMI 1640培养液中,经不同时间培养后,高效液相色谱法测定细粒棘球蚴囊内的药物质量浓度,以评价不同功率及辐照次数、辐照后含药培养液中不同培养时间对囊壁药物通透性的影响.结果显示:多频聚焦超声照射可以改变细粒棘球蚴囊壁的药物通透性.三频联合与单频相比,以及两次以上照射与单次照射相比,细粒棘球蚴囊内药物质量浓度差异均具有统计学意义.照射后包囊继续在含药培养基中培养,可进一步提高囊内药物质量浓度.本研究证实多频聚焦超声照射可使细粒棘球蚴囊壁药物通透性持续增加.多频联合超声作用的效果明显优于单频、多次照射优于单次照射.多频多次照射、适当延长包囊在药物中的培养时间能够最大程度地提高囊内药物质量浓度.     

生物素-抗生物素系统斑点免疫结合试验检测棘球蚴病患者的免疫应答

建立了生物素-抗生物素系统斑点免疫结合试验(BAS-DIBA),并以此法研究了棘球蚴病患者对细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)抗原的免疫应答.79例棘球蚴病患者血清、69例非棘球蚴病患者血清和119例健康人血清的BAS-DIBA试验结果为:两试验检测抗棘球蚴抗原抗体的敏感性分别为97.45%和92.41%;特异性分别为98.40%和98.94%;在91.14%的棘球蚴病患者血清中,BAS-DIBA试验较DIBA法敏感;两法同为阳性的棘球蚴病患者血清中,BAS-DIBA检出的抗体效价的几何均数为DIBA法的5.48倍;4例DIBA试验阴性的棘球蚴病患者血清在BAS-DIBA法中为阳性.证实所建立的BAS-DIBA法是检测棘球蚴病患者免疫应答敏感性高、特异性强的方法,特别是对于低抗体水平的棘球蚴病患者可能具有更高的应用价值.     

绵羊细粒棘球蚴Ag B基因的克隆、表达及其重组蛋白纯化

为克隆、表达绵羊细粒棘球蚴Eg Ag B基因,并纯化重组蛋白,采用PCR方法从绵羊肝脏包囊病料中扩增Ag B基因,克隆入p MD18-T载体中,测序后进行序列分析。将Ag B基因亚克隆入原核表达质粒p ET-28a中,转化入E.coli BL21感受态细胞中,用IPTG诱导Ag B蛋白表达,并对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:克隆的Ag B基因全长333 bp,通过SDS-PAGE可以检测到分子量为20 ku的特异性重组蛋白,与预期值相符;Western blot分析结果显示,该蛋白可与Eg阳性血清发生免疫学反应。本研究在大肠杆菌中成功表达的绵羊细粒棘球蚴Ag B蛋白,并证实其具有良好的反应原性,为绵羊细粒棘球蚴感染检测试剂的研发奠定了基础。     

细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3和Eg10免疫差异的初步研究

表达纯化细粒棘球蚴重组蛋白14-3-3(rEg14-3-3)和Eg10(rEg10),分别免疫小鼠,8w后进行细粒棘球蚴原头蚴攻击感染.计算免疫保护力,检测脾组织中CD4+T、CD8+T细胞亚群以及T细胞增殖情况.实验结果表明,rEg14-3-3免疫组小鼠具有85.3%抵抗细粒棘球绦虫感染的能力,而rEg10免疫组小鼠与对照组小鼠相比无免疫保护力;与PBS对照组相比,只有rEg 14-3-3免疫组的CD4+T细胞亚群的分布有明显差异,且rEg 14-3-3抗原能诱导淋巴细胞显著增殖.因此rEgl4-3-3蛋白能抑制细粒棘球蚴的生长,诱导小鼠产生高水平的免疫保护力,可作为疫苗候选分子.     

细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

为了表达、纯化细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白及制备多克隆抗体,本研究构建细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白原核表达载体p ET30a-M26,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的副肌球蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对副肌球蛋白及抗体进行检测。结果显示:成功表达并纯化了细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白,重组蛋白分子质量约41 k D,纯化后目的蛋白纯度可达85%,蛋白浓度为0.5mg/ml。副肌球蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1∶12800,结果表明,成功表达并纯化了六钩蚴副肌球蛋白。本研究可为研究包虫病早期诊断奠定了基础。     

纳米化阿苯达唑对细粒棘球蚴原头节生长的影响

目的观察比较阿苯达唑粉剂和纳米化阿苯达唑在体外对细粒棘球蚴原头节作用的影响。方法将阿苯达唑粉剂溶解于DMSO后与纳米化阿苯达唑分别配成3.13、6.25、12.5、25μg/m L浓度,按照所设分组体外培养,倒置显微镜下观察各药物处理组经伊红染色后原头节的形态及活力。ELISA试剂盒测定药物作用3、6 d后原头节体内抗氧化酶NQO-1的活性变化。结果将相同条件下阿苯达唑粉剂和纳米环阿苯达唑各浓度组原头节的活力较空白对照组降低。12.5、25μg/m L浓度组纳米化阿苯达唑酶活性变化高于阿苯达唑粉剂组。结论阿苯达唑粉剂和纳米阿苯达唑均有不同程度的体外抗细粒棘球蚴原头节作用;纳米化阿苯达唑在体外抑制细粒棘球蚴原头节生长作用优于普通阿苯达唑粉剂,有望成为治疗细粒棘球蚴病的一种新的剂型。     

AZD2014对体外细粒棘球绦虫原头蚴活性影响的研究

目的探讨双TOR抑制剂AZD2014在体外对细粒棘球绦虫原头蚴活性的影响。方法细粒棘球绦虫原头蚴分成6组进行体外培养,其中四组加入AZD2014使其浓度分别为200、100、50、25μmol/L;继续培养10 d,期间利用伊-红染色方法在倒置显微镜下观察原头蚴的活力,实验重复3次后,绘制原头蚴活力曲线;Western-blot检测100μmol/L的AZD2014培养原头蚴4 d后的p-Akt1、p-4EBP1、p-S6K1的表达量;Caspase-3试剂盒检测100μmol/L的AZD2014培养原头蚴4 d后的Caspase-3酶活性。结果 100μmol/L的AZD2014作用4 d后,原头蚴活性开始下降,存活率为(75.93%±7.28%);体外培养10 d后,100μmol/L组原头蚴活力仅为(24.03%±1.01%),200μmol/L组原头蚴活力为(2.40%±1.14%);100μmol/L的AZD2014培养4 d后,原头蚴蛋白因子p-Akt1、p-4EBP1、p-S6K1表达量明显下降;在100μmol/L的AZD2014培养原头蚴4 d后,其Caspase-3酶活性下降。结论 AZD2014在体外具有抗细粒棘球蚴原头蚴的作用,理论上,可做为临床上抗包虫的新型药物。     

黄海带鱼、小带鱼RAPD和线粒体16S rRNA基因序列变异分析

对黄海带鱼、小带鱼各12个个体进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析,对比多态位点比例、遗传多态度以及遗传距离,并构建Neighbor-joining系统树;通过PCR扩增出线粒体16SrRNA基因,纯化后直接测序,利用生物信息学方法进行序列分析和核苷酸变异比较,结合GenBank上大西洋叉尾带鱼同源序列构建UPGMA系统树.分析结果表明:(1)RAPD技术研究黄海带鱼和小带鱼的遗传多样性具有较高的灵敏度和检出率,带鱼的多态比例和遗传多态度均较小带鱼的低;(2)线粒体16S rRNA基因序列在分析这两物种遗传变异时表现出保守和变异的双重特性,种内变异极小而种间较大;(3)5个随机引物扩增出种特异的RAPD带,可作为种间分子鉴定标记;(4)研究证实带鱼和小带鱼是不同属的两个种,从而在基因水平上支持了Nelson分类系统的观点.     

罗汉果性别相关的RAPD标记

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术寻找与罗汉果性别相关的分子标记,筛选了130个10 bp的随机引物,发现有4个引物(S60、S90、S100、S343)能在雌、雄株DNA间扩增出5条差异性片段,大小在300~1 300 bp之间,表明这些特异带可被用来作为性别鉴别的特异性分子遗传标记。     

包虫病基因工程疫苗免疫效果考核试验

包虫病基因工程疫苗完全可抗我国细粒棘球绦虫犬——绵羊株对中间宿主(绵羊)的侵袭。在包虫病流行区免疫羊可获得保护。免疫期约半年新疆细毛羊免疫保护率为88．1％；蒙古黑头羊为83．6％。     

棘球蚴抗原纯化对免疫球蛋白IgG免疫应答的影响

以纯化的棘球蚴抗原和未经纯化的粗抗原用于棘球蚴感染者血清中抗棘球蚴抗原的特异性免疫球蛋白IgG水平的检测试验,结果表明,当血清稀释度为1∶200时,使用纯化抗原可以获得较高的特异性 (98.9%),并可保持在使用粗抗原及血清稀释度为1∶400时获得的较高的敏感性（93.7%）,提示在棘球蚴感染者血清中抗棘球蚴抗原特异性免疫球蛋白IgG水平的检测中,使用纯化棘球蚴抗原和粗抗原均可获得较高的敏感性(93.7%)和较高的特异性 (98.4%,98.9%),使用纯化抗原时的特异性略高,但在统计学上并无显著差异.     

新疆绵羊棘球蚴病流行情况调查分析

对绵羊棘球蚴病在新疆维吾尔自治区和新疆生产建设兵团的流行情况进行了调查分析 ,结果表明 :绵羊棘球蚴病发病单位数 (团场 )、发病率和死亡率逐年升高 ,而致死率逐年下降 ;北疆地区绵羊棘球蚴平均感染率为 6 1 .2 5± 3 .6 5 % ;南疆地区平均感染率为 3 8.89± 2 .93 % ,北疆地区平均感染率明显地高于南疆地区 (P <0 .0 1 )。其中北疆各地区之间、南疆各地区之间平均感染率没有显著差异 ,而阿克苏地区棘球蚴平均感染率极显著地低于伊犁地塔城和昌吉地区 (P <0 .0 1 ) ,显著低于阿勒泰地区 (P <0 .0 5 ) ;喀什地区极显著地低于伊犁地区 (P <0 .0 1 ) ,显著低于塔城、阿勒泰和昌吉地区 (P <0 .0 5 )。兵团农一师和农三师绵羊棘球蚴平均感染率也显著地低于其他各师局     

斜带石斑鱼、赤点石斑鱼RAPD和线粒体Cyt b基因序列变异分析

斜带石斑鱼和赤点石斑鱼为具有重要经济价值的海水鱼类。对这两种石斑鱼进行了随机扩增多态DNA(RAPD)和线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列变异分析。计算多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数,以此评估种内遗传变异水平;通过统计变异位点、平均核苷酸差异数、核苷酸多样性以及种间平均每位点核苷酸替代数进行基因序列变异分析,并构建UPGMA系统树。结果表明:斜带石斑鱼的遗传多样性水平高于赤点石斑鱼,这可能与它们在种内特定遗传结构、分布范围大小、自然资源状况的差异有关;斜带石斑鱼和赤点石斑鱼之间检测到的种特异RAPD条带以及基因序列的变异,可作为种间分子鉴定标记。     

油松遗传多样性研究的ISSR—PCR体系优化与初步应用

以油松基因组DNA为模板,对影响ISSR-PCR的主要因素进行研究,建立了适宜于油松的ISSR-PCR优化体系及扩增程序;并采用lSSR标记对山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的遗传多样性进行了分析,同时将此结果与使用RAPD标记的研究结果进行了对比.结果表明,在20μL反应体系中,模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物5种主要成分的最适浓度分别为40 ng、2.5 mmol·L-1、0.20 mmol·L-1、1 U和0.5 μmol·L-1.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30s,最适温度(54～56℃)退火45s,72℃延伸2min.共计35个循环;循环结束后72℃延伸7min,4℃保存.山西灵空山和陕西洛南2个油松种群的Nei's遗传多样性分别为0.3520和0.3514,前者的遗传多样性显著高于后者(P<0.001).使用ISSR标记与RAPD标记所获结果基本一致,但是lSSR标记优于RAPD标记.     

羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析

通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物, 应用PCR技术的特异性扩增了羊传染性脓疱病毒JLSY04株的F1L基因片段, 测序得到了该病毒F1L基因序列, 并与几个参考毒株序列进行比对. 实验结果表明, 羊传染性脓疱病毒JLSY04株与OV/Torino株同源性最低, 为96.0％, 与Jilin株同源性最高, 为99.4%. 即该羊传染性脓疱病毒JLSY04株F1L基因与其他参考毒株间的差异较小, 可作为基因工程疫苗的目的基因.     

细粒棘球蚴囊液抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应

目的 观察细粒棘球蚴囊液对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子的影响,并探讨其可能的机制。方法 培养小鼠巨噬细胞,分为四组处理：对照、囊液(2.15 mg·mL^-1)、LPS(1μg^-1mL^-1)以及LPS+囊液。刺激5 h后,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-10的表达;刺激1 h后,免疫印迹法检测STAT3和p-STAT3的蛋白水平。结果 囊液能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中IL-6和TNF-α的mRNA表达,却明显促进IL-10的表达。进一步发现囊液能促进STAT3信号的活化水平,而当使用STAT3的抑制剂S3I-201后,STAT3的磷酸化水平明显降低,同时回升了TNF-α的表达。结论 细粒棘球蚴囊液能抑制RAW264.7细胞炎症反应,IL-10/STAT3信号通路可能参与调控此过程。