荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

枯草芽孢杆菌是生物工业用的重要宿主体系。为实现荧光蛋白从分子水平定量追踪枯草芽孢杆菌培养过程的目的,构建了一系列整合型表达载体pX-GFPmut1和游离型表达载体pSW1-GFPmut1,pSW1-CFP,pSW1-YFP,研究了不同颜色荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中整合型表达和游离型表达的差异。最适合的荧光蛋白表达体系是用游离型质粒pSW1-GFPmut1在枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白GFPmut1。含pSW1-GFPmut1枯草芽孢杆菌通过木糖诱导表达GFPmut1后,细胞破碎后的荧光强度和细胞浓度呈线性关系。结果表明,利用枯草芽孢杆菌表达荧光蛋白可以实现利用荧光蛋白快速定量枯草芽孢杆菌培养过程。     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

将来源于枯草芽孢杆菌WB600的启动子PyxiE与碱性蛋白酶基因进行融合,将融合片段插入到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4中,构建了表达质粒pSUPyAp. 将该质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到转化子pSUPyAp/WB600,它在启动子PyxiE驱动下,能够在牛奶平板上产生透明的水解圈,其发酵上清液中的碱性蛋白酶活性最高为518.5 U/mL,其酶活分别是在启动子Bp53和P43驱动下的3.01倍和1.22倍.     

苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达

根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.     

枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是当今工业酶的主要生产菌种之一,由于其产酶量高、种类多、安全性好、环保等优点在现代工业生产中被广泛应用,其发酵生产的酶在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸、医药等领域均发挥着十分重要的作用。本文详细地综述了枯草芽孢杆菌工业酶的应用情况,对其发展趋势进行了展望。     

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是工业应用中一种重要的模式菌株,具有非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,是异源蛋白表达和分泌的理想宿主。高效可控的启动子是实现外源蛋白高效表达的关键因素之一。根据诱导机制,启动子可分为组成型启动子、诱导型启动子、自诱导启动子和时期特异性启动子。本文介绍了枯草芽孢杆菌表达系统、芽孢杆菌σ因子类型及枯草芽孢杆菌启动子的结构,比较了常用启动子的优缺点,总结了新启动子克隆和改造及生物信息学预测启动子的方法,并对枯草芽孢杆菌启动子未来的研究方向进行展望,为进一步研究启动子的结构和功能及工业生产外源蛋白奠定基础。     

绿色荧光蛋白(GFP)基因在短小芽孢杆菌中的组成型表达

采用PCR技术,亚克隆来自短小芽孢杆菌总基因组中的启动子活性片段F1,构建了一个大肠杆菌-短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-F1gfp,以缺失启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,检测了该片段在短小芽孢杆菌DX01菌株中的启动活性,在荧光显微镜下,观察到了明亮的绿色荧光,证实活性片段F1具有组成型启动子的功能,GFP基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达．     

驱油枯草芽孢杆菌产芽孢条件优化

试验研究了采油微生物枯草芽孢杆菌的芽孢形成及萌发过程。结果表明,最适产芽孢培养基为(g/L):氯化钠5,牛肉膏5,酵母膏2,可溶性淀粉20。最适中间调控pH为9.0,最适中间调控温度为45℃。活菌总数达到1.6×10~9CFU/mL,芽孢数达到2.2×10~8CFU/mL,芽孢率为13.8%。对枯草芽孢杆菌进行3 L发酵罐研究,确定了芽孢形成的最佳搅拌转速为140 r/min,同时确定了芽孢在低转速下也可以萌发。     

短小芽孢杆菌质粒pCJ转化枯草杆菌的研究

本文采用我国自己分离的短小芽孢杆菌抗四环素质粒pCJ3转化枯草杆菌的各种突变体.质粒DNA经氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化后转化枯草杆菌的感受态细胞.结果表明枯草杆菌BR151,SB202,168,QB1130及QB1133都可作为质粒pCJ3的受体,转化效率在10~3左右,其中以SB202这株突变体为最高,从各种转化体中提取的质粒及经BamHI消化后的质粒的电泳图均与原质粒pCJ3及其BamHI酶切片段相同,并具有pCJ3的抗四环素转化活性.将pCJ3DNA经BamHI酶切后重新用T_4-DNA连接酶连接再转化枯草杆菌细胞,其转化效率比原质粒高1—2个数量级.研究了二价金属离子、pH及培养基成分对转化的影响,结果证明:Ca~(++)对枯草杆菌转化有促进作用,Cu~(++),Zn~(++)则有抑制作用,转化的最适pH在7.2—7.5之间;营养丰富培养能提高转化效率.     

大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达

为了对大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码的３－脱氧－Ｄ－阿拉伯庚酮糖酸－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ合成酶）进行结构与功能的深入研究,尝试了ａｒｏＧ基因在枯草杆菌中的表达。表达载体以ｐＵＢ１１０为骨架,采用了枯草杆菌热激蛋白ｇｒｏＥＳＬ基因的启动子,碱性蛋白酶ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ基因的信号肽和Ｎ－乙酰胞壁酸－Ｌ－丙氨酸酰胺酶ｃｗｌＨＢ基因的转录终止子,将ａｒｏＧ基因在枯草杆菌ＷＢ６００宿主菌中进行了分泌表达     

ribR基因在产核黄素枯草芽胞杆菌中的组成型表达

枯草芽胞杆菌ribR基因编码单功能黄素激酶,催化核黄素转化为FMN.ribR基因作为ytmI-ytnM操纵子的一部分,其表达调控机制尚不清楚.用PCR方法扩增了枯草芽胞杆菌veg基因的启动子vegP,连接到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pHP13上,构建了表达型重组质粒pHP13-V.用PCR方法扩增了ribR基因,连接到pHP13-V上,构建了重组质粒pHP13-VR.将pHP13-VR转化产核黄素的枯草芽胞杆菌24A1,使ribR基因在24A1中组成型表达,得到菌株24A1/pHP13-VR.与24A1相比,24A1/pHP13-VR菌落由亮黄色变为微黄色,核黄素产量下降为1.26 mg/mL,下降了45%.结果说明,在ribC基因突变背景的过量合成核黄素枯草芽胞杆菌中,ribR基因的存在对菌株的核黄素发酵有一定的抑制作用.     

中温α-淀粉酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的高效表达

利用高效表达栽体pWB980,实现了Bacillus subtilis BF7658中温α-淀粉酶基因amy在B.subtilis DB403中的高效表达,活力达到770 U/mL.经多步纯化,重组酶AMY的比活达到35.8 U/mg,纯化倍数为1.7,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,重组酶AM...     

甜味蛋白Brazzein在Escherichia coli和Bacillus subtilis中的表达研究

通过实验对比研究了植物来源的甜味蛋白Brazzein单独及与E coli信号肽融合表达的情况,证实无信号肽序列的Brazzein编码基因实现了可溶性活性表达,它的肽链N端未融合其他氨基酸或肽链.同时,在Brazzein肽链中引入31His→Ala的突变,依照Bacillus subtilis的偏爱密码子,合成了定点突变后的Brazzein编码序列,并在B.subtilis WB600中实现了可溶性胞内表达,得到了表达量较高的活性蛋白产物.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

枯草芽孢杆菌BS-6液体发酵条件的研究

通过单因素实验和正交实验,研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-6的液体发酵培养基和工艺条件,确定最佳的培养基为:蔗糖3%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%,KH2PO4 0.45%,(NH4)2SO40.25%,碳酸钙0.2%;最适发酵条件为:温度30℃,pH值7.0,装量20ml/250ml锥形瓶,转速200r/min。