酵母snR72￣78snoRNA基因簇的研究

通过ＰＣＲ分析发现ｋｌｕｙｕｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｅｌｐｈｅｎｓｉｓ中存在与酿酒酵母相似的ｓｎＲ７２～７８ｓｏｎＲＮＡ基因簇。对该基因簇进行序列测定并与酿酒酵母比较分析,发现基因簇中各个ｓｎｏＲＮＡ编码区具有一定的保守性,但是基因间隔区却有完全不同的序列,这表明ＲＮａｓｅⅢ对ｓｎｏＲＮＡ前体加工的识别信号存在于各ｓｎｏＲＮＡ基因间隔的高级区的高级结构中。进一步对另外４种酵母进行ＰＣＲ分析,结果表明ｓ     

醇酒酵母反义snoRNA一级结构的分析

对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组中发现和鉴定的41个反义snoRNA进行一级结构的分析表明：酿酒酵母snoRNA基因富含AT：41个反义snoRNA全都有boxC'和boxD'结构元素；根据反义snoRNA保守结构元素及反义序列的数目和位置的特点，将反义snoRNA分为5种结构类型，认为snoRNA具有两个主要的功能区；在snR57、snR59、snR71和snR75不具有指导甲基化反义序列的功能区中，发现有一段长10－12个核苷酸的序列与rRNA互补，为进一步研究反义snoRNA的结构与功能提供了重要线索。     

粟酒裂殖酵母snR41 snoRNA的鉴定及其结构进化的意义

采用计算机分析和分子生物学实验的方法,在粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中发现和鉴定了一种新的反义snoRNA,命名为snR41,与酿酒酵母Sacharomyces cerevisiae snR41同源分子比较,粟酒裂殖酵母snR41只具有一个指导rRNA核糖甲基化的反义序列,这一发现进一步揭示了反义snoRNA同源分子在一级结构上的多样性,为研究反义SnoRNA结构及进化提供了新的线索。     

粟酒裂殖酵母SnoRNA snR90基因缺失株的筛选鉴定

snR90是在粟酒裂殖酵母中发现的一种单基因编码的box H/ACA类snoRNA.在利用遗传手段在粟酒裂殖酵母基因组中敲除了snR90基因后,通过选择性培养基、PCR、Northern杂交这一系列方法筛选鉴定出snR90基因缺失株.该基因缺失株ΔsnR90的成功构建对snR90功能的分析很有的意义.     

核仁小分子RNA及其基因组织形式

核仁小分子RNA(snoRNA)是非编码RNA中研究得最多,了解得最详细的成员之一。依据snoRNA保守的序列和结构元件可将其分成三类:box C/D snoRNA,box H/ACA snoRNA以及MRP RNA。它们的主要功能分别为指导rRNA或snRNA中特异位点的2′-O-核糖甲基化修饰、假尿嘧啶化修饰或作为分子伴侣参与靶标RNA高级结构的形成。目前发现的snoRNA基因组织主要有四种形式:独立基因编码的snoRNA、内含子编码的snoRNA、多顺反子snoRNA基因簇和内含子编码的snoRNA基因簇。但是,并不是每种生物都具有这四种基因组织形式。大多数脊椎动物的snoRNA产生于蛋白质基因的内含子中,植物snoRNA基因多以基因簇的形式存在,大部分酵母snoRNA由独立基因编码,锥体虫snoRNA以多顺反子形式存在,果蝇snoRNA基因都位于宿主基因的内含子中。随着对snoRNA研究工作的不断深入,snoRNA基因组织形式也呈现出前所未有的复杂性和多样性。     

基于表达序列标签的萝卜ACA36基因簇鉴定

利用国际公用的表达序列标签（EST）数据库资源,运用生物信息学分析方法,在萝卜（Raphanus sativus）一条表达序列标签中发现一个新的snoRNA基因簇。此基因簇含有一个box H/ACA snoRNA基因和两个box C/D snoRNA基因,分别命名为RsACA36、RssnoR66和RsSNORD88。ACA36可形成典型的box H/ACA snoRNA双茎环二级结构;snoR66和SNORD88都具有典型的C盒与D盒保守元件,末端存在反向互补序列;三个snoRNA都含有能和核糖体RNA互补配对的反向互补序列。RsACA36和RsSNORD88均为在植物中首次发现。基于EST数据库、运用生物信息学方法鉴定snoRNA基因既保留了计算机RNA组学快捷、高效的优点,又使结果因为有了实验支撑而更直接、可信。     

酵母snoRNA基因簇启动子的比较分析

报道对酿酒酵母ｓｎｏＲＮＡ基因簇启动子序列的研究结果．通过计算机分析,发现酿酒酵母中Ｚ２Ｚ８和ＳｎＲ１９０Ｕ１４ｓｎｏＲＮＡ基因簇有相似的启动子结构．这两个ｓｎｏＲＮＡ基因簇都是由一个上游的启动子负责整个基因簇的转录,产生多个顺反子ｓｎｏＲＮＡ的前体,然后再加工成熟为各个独立的ｓｎｏＲＮＡ．在启动子保守序列ＴＡＴＡｂｏｘ的上游还发现２个ＲＡＰ１序列,表明ｓｎｏＲＮＡ基因簇的表达可以通过ＲＡＰ１元素与核糖体蛋白基因的表达协同调控．这是在ｓｎｏＲＮＡ基因的启动子中首次发现ＲＡＰ１调控元素．对ｓｎｏＲＮＡ基因簇的进化特点也进行了讨论．     

两种相邻分布的水稻U14 BoxC/D snoRNA

通过对酵母U14BoxC/DsnoRNA保守元件的分析,推测出水稻BoxC/DsnoRNA可能具有的保守序列,进而在水稻第二号染色体上找到可能编码两种BoxC/DsnoRNA的序列.这两个BoxC/DsnoRNA在染色体上相邻分布,具有典型的BoxC和BoxD序列,末端形成茎环结构,这也是BoxC/DsnoRNA一个显著的特点.它们含有一段相同的“引导”序列,此序列能与水稻18S核糖体RNA(rRNA)第414位到第427位互补配对,这两者可能行使相同的功能:介导此配对区域内rRNA的核糖的甲基化.通过实验证明:(1)水稻18S核糖体RNA的配对区域内的确存在甲基化修饰;(2)这两种BoxC/DsnoRNA存在于水稻细胞中.通过序列同源性比较发现与玉米U14snoRNA有很高的同源性.将这两种在水稻中发现的BoxC/DsnoRNA命名为U14.1snoRNA和U14.2snoRNA.编码这两种BoxC/DsnoRNA的基因已被GenBank收录,其编号为AF332622.     

苏云金芽孢杆菌cry1I基因沉默的研究

分析了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry1和cry1I基因的保守区,在cry1类基因的下游和cry1I基因的上游设计了一对通用引物,用于检测cry1I与cry1类基因的连锁现象.从鉴定的142株Bt分离株中,PCR扩增发现71株出现约1.4kb的阳性带,说明这一现象广泛存在于Bt菌株中.在此基础上用pGEM-T Easy载体克隆了菌株Bt07和J8中的连锁序列,序列分析表明,Bt07中是cry1I基因与cry1Db基因连锁,间隔区为504bp;J8中是cry1Ia基因与cry1Ac基因连锁,间隔区为506bp.进一步比较间隔区序列,同源性达93.7%,同时含有多个原核生物终止序列,且未发现启动子序列,揭示了这两个菌株中cry1I基因沉默的成因.     

灰枣和酸枣叶绿体trnL-trnF基因序列分析

以灰枣和酸枣叶片为材料,用改良的CTAB法提取总DNA,用通用引物对枣叶绿体trnL基因内含子和trnL-trnF间隔区进行PCR扩增,得到了trnL基因内含子和trnL-trnF间隔序列片段,并对trnL-trnF间隔序列片段回收测序,测序结果符合植物叶绿体基因trnL-trnF间隔序列特征,用DNAMAN软件进行同源性分析,结果表明灰枣和酸枣trnL-trnF基因序列同源性为94．78％.枣和酸枣的分类学地位是一个长期争议的问题,初步开展了灰枣和酸枣叶绿体基因序列分析的研究,为研究枣和酸枣分子系统进化提供参考.     

Z25，哺乳动物核仁蛋白基因编码的一个新的内含子snoRNA

通过计算机分析和实验鉴定,发现了哺乳动物中一种新的内含子snoRNA． Z25．Z25 snoRNA长为69个核苷酸,具有典型的boxC／D结构元件和末端配对区,一 段长为11个核苷酸的序列与18S rRNA互补,其下游紧接boxD’．按照理论计算,Z25 snoRNA具有指导18S rRNA中A1678(按人18S rRNA编号)2’．0．核糖甲基化的功能． Z25基因位于人、小白鼠和大鼠核仁蛋白(Nucleolin)基因第5个内含子中,揭示出哺 乳动物核仁蛋白基因是一种多内含子snoRNA编码的宿主基因．     

嗜甲基细菌Serratia Marcescens NH8的筛选及其pqq基因的克隆

以甲醇为唯一碳源,从土壤中筛选获得一株长势优良的嗜甲基营养菌NH8,对其16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）,命名为Serratia marcescens NH8.通过下载数据库中pqq基因簇序列进行多重比对,设计PCR扩增引物,从Serratia marcescens NH8中成功克隆出吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline Quinone,PQQ）合成相关的pqq基因簇片段.该基因簇序列全长5 535 bp,由6个开放阅读框pqqA,pqqB,pqqC,pqqD,pqqE和pqqF组成,并且与Serratia marcescens WW4的pqq基因簇序列同源性为99%.同时,对pqq基因簇中各基因的结构与功能进行了分析,核酸序列分析结果表明pqqB,pqqC,pqqD,pqqE和pqqF基因构成细菌操纵子发挥作用.     

粗糙脉孢菌U3 snoRNA基因的鉴定及其表达和功能分析

通过对粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）小RNA的cDNA文库筛选及基因组分析,鉴定了3个U3snoRNA基因,命名为NcU3A、NcU3B和NcU3C,这3个基因表达的U3snoRNA的大小分别为262,270和275nt．同时,Northern杂交还揭示出不同大小的U3snoRNA剪切变体,表明U3 snoRNA的表达存在复杂的转录后加工．粗糙脉孢菌U3snoRNA都具有物种间保守的与18SrRNA配对的功能区;NcU3A及其剪切变体还具有一段过去没有报道的与26SrRNA互补的反义序列,这段反义序列并不指导对应的rRNA位点的甲基化修饰,可能具有rRNA分子伴侣的作用．粗糙脉孢菌U3 snoRNA都是独立转录的基因,每个基因中均包含一个小内含子序列,其插入位点与酵母U3相似,表明它们古老的起源．研究结果对阐明U3 snoRNA的结构进化及功能多样性具有重要意义．     

海洋球石藻病毒甾醇去饱和酶基因的克隆与表达

以海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒EhV-99B1基因组为模板,用一对病毒甾醇去饱和酶(sterol desaturase,SD)基因的特异性引物进行PCR扩增,获得EhV-SD基因,将扩增产物克隆至pMD19-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将测序正确的目的基因亚克隆入酿酒酵母表达载体pYES2/CT中,转化酿酒酵母缺陷型菌株YMR015C,并用D-半乳糖诱导表达,提取重组酵母和野生型酵母细胞总脂并进行薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)分析。结果显示:EhV-SD基因全长为987 bp,编码328个氨基酸,该蛋白质的理论等电点为8.31,预测的蛋白质分子质量为37.83 ku,为疏水性、不稳定蛋白质,存在6个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中,α-螺旋含量最多。氨基酸序列比对结果显示,EhV-SD基因与宿主球石藻及金色藻属(Chrysochromulina sp.CCMP 291)亲缘关系较近。TLC结果表明,EhV-SD基因的表达导致酵母细胞极性较强的脂类明显减少,而极性较弱的脂质成分显著增加,表明EhV-SD具有一定的催化活性。     

rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用

根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增特定的2．2kb rDNA片段,并以此替换酿酒酵母(Saccharomyces cereristae)整合载体YIp5的URA3片段;在此基础上,引入G418抗性基因KanMX和酵母磷酸甘油激酶(phosphoglycerale kinase,PGK)组成型强启动子和终止子序列(PGKp-t),构建适合酿酒酵母工业菌株高拷贝整合表达载体pYMIKP,以细菌木糖异构酶(xylose isomerase,XI)基因xy/A为目标基因,通过载体pYMIKP引入到酵母工业菌株NAN-27中,酵母转化子在非选择培养条件下,连续生长50世代质粒稳定性为99．72％,目标基因高拷贝重组菌的木糖异构酶比酶活是对照菌株的67．2倍,达到0．672U／mg蛋白,实现了外源基因在酿酒酵母工业菌株中的稳定高效表达。     

ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷贝整合表达载体的构建

利用PCR技术,以酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板,扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602bp的开放读码框,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定,测序结果与GenBank上已登录的ScINO1序列完全一致.对PUG6载体进行改造,构建了rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH,并将ScINO1基因连入载体pURH,获得ScINO1基因超表达载体pURIH.为下一步的微生物发酵法产肌醇和获得能够耐高乙醇的酵母工程菌株的研究奠定基础.     

两个新的粟酒裂殖酵母box H/ACA snoRNA的鉴定、功能分析及进化意义

通过构建粟酒裂殖酵母核小分子RNA的cDNA文库,发现并鉴定了两个新的非编码RNA,分别命名为Sp15-70和Sp18-61.生物信息学分析揭示这两个RNA均具有典型的box H/ACA snoRNA二级结构特征和与rRNA互补的配对区,推测Sp15-70具有指导25S rRNA中U2401和U2298假尿嘧啶修饰的功能;Sp18-61具有指导18S rRNA中U208和25S rRNA中U2341假尿嘧啶修饰的功能.采用CMC-引物延伸法证实:在粟酒裂殖酵母rRNA中,这4个预测位点确实为假尿嘧啶修饰核苷酸.Sp15-70和Sp18-61均由单拷贝基因编码,分别位于粟酒裂殖酵母染色体工和Ⅲ上蛋白质基因的间隔区,在其5'端上游均发现了典型的TATA box元件,表明它们都是独立转录的基因.比较分析这两个snoRNA在不同生物中的功能性同源分子,发现snoRNA基因在进化的过程中发生了广泛的分子重组和转位.     

利用Cre-LoxP重组系统构建gdh1基因敲除的酿酒酵母重组菌

基于PCR介导的基因敲除原理,采用Cre-LoxP重组系统技术,对2倍体酿酒酵母的SS04菌株的gdh1基因进行敲除操作,构建gdh1基因完全缺失型的酿酒酵母重组菌SS17菌株,进而为后续重组酵母的乙醇代谢研究打下基础.     

酿酒酵母启动子上游序列在基因表达中的作用

近几年的研究发现,不仅在原核生物中启动子上游非编码区存在着对基因表达的调控序列,而且在真核生物中启动子上游非编码区也存在着对基因表达的调控序列。从酿酒酵母十多个基因上游非编码区的研究结果看,这些调控序列在结构与功能上都有一定的特殊性。除TATA box外,这个区段在不同的结构基因之前都有不同的核苷酸序列,     

甜菜夜蛾核多角体病毒基因组13.7～21.6 m.u.区域的分析

甜菜夜蛾核多角体病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)基因组13．7～21．6m．u．区域是SeMNPV的重组热点区。以SeMNPV美国分离株SeUS1为模板,长片段PCR对SeUS1的13．7～21．6m．u．区域扩增,得到11．3kb,2．0kb和0．7kb3个片段。对照已发表的SeMNPV基因组序列,11．3kb片段是具完整SeMNPV序列基因型的产物,2.0kb和0．7kb片段表明SeUS1中还存在两种缺失突变株。对2．0kb和0．7kb片段的序列分析揭示了这两株突变株在缺失部位的DNA一级结构。对三株重组SeMNPV病毒(SeXDl、SeXD2和SeXD3)的分析发现,它们和野生型病毒SeUS1中的一个基因型一样,均缺失了SeMNPV nt 18513～29105之间长10593bp的片段,暗示SeUS1中一株自发形成的缺失突变体在离体细胞中具有复制优势。将该片段基因排列与其它10种基因组序列已测定的杆状病毒比较,发现两个在GroupⅡ NPVs中保守的基因簇。最大简约性法对部分基因的系统发育分析表明,缺失片段中某些基因可能存在于杆状病毒分化之前的病毒基因组中。