大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以总DNA为模板，采用PCR技术克隆得到运动发酵单胞菌(Zymamonas mobilis）丙酮酸脱羧酶(pyru—Vate decarboxylase)基因pdc，将该基因连接到表达裁体pSE380上，得到重组质粒PSE—pdc,将此重组质粒转化到受体菌E．coliDH5α中，挑取重组菌株．经IPTG诱导后，在乙醛指示平板检测到丙酮酸脱羧酶活性．SDS—PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带：其分子量约为60KD．     

枯草杆菌启动基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以大肠杆菌启动基因选择载体pHE5为载体,枯草杆菌染色体DNA为供体,克隆了一批启动基因功能片段,带克隆片段的重组质粒在大肠杆菌中表现不同的四环素抗性水平,其中50%在100μg/ml以上,12%达到200μg/ml。对其中一个转化子进行质粒检测和分析,获得一个重组质粒pHE273,经酶切分析证明,克隆的强启动基因位于2.2kb的EcoRI-HindⅢ片段上。     

牛泡沫病毒跨膜蛋白的穿膜区具有细胞毒性作用

泡沫病毒(FV)具有广泛的宿主范围,可以感染从人到鱼几乎所有脊椎动物细胞,可见其包膜蛋白具有极强的膜融合能力.分析牛泡沫病毒(BFV)的跨膜蛋白(TM),在其C端存在一个穿膜螺旋区,其中含有连续的疏水氨基酸.本文以BFV3026原病毒DNA为模板,利用PCR分段扩增TM编码区,克隆原核表达载体pET32a( ),序列分析证实后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,仅有穿膜区完全缺失的TM3获得表达,其余含有完整或部分穿膜区的TM1及TM2均未表达.表达菌生长状态测定显示:TM穿膜区C端疏水氨基酸串联区对细胞具有强烈致死效应.同时利用金属螯合层析对所表达TM3蛋白进行初步纯化,Westernblot证实其有良好的抗原性.     

兔脑组织因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达

重组组织因子(recombinant tissue factor,rTF)是新一代凝血酶原时间检测(PT)试剂的主要成分.从新鲜兔脑组织提取总RNA,通过RT-PCR得到TF全长编码基因,并克隆到pMD19-T载体.以测序验证正确的重组子为模板,扩增TF基因并构建成融合表达质粒pMAL-c2X-TF,并将其转化到DH5α中.SDS-PAGE和Western blotting证明,菌体诱导后形成可溶性的融合表达产物,该融合蛋白通过亲和层析纯化和凝血因子X a水解成为游离的TF蛋白,该蛋白通过脂化,制备成重组PT试剂.凝血试验表明,该试剂对血浆有明显的促凝活性.     

人色素上皮衍生因子(PEDF)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

实验主要是应用基因重组技术从人胎盘中克隆人的PEDF基因，构建了pBV/PEDF重组质粒，并使之在大肠杆菌中诱导该因子表达成功，这为PEDF蛋白的获取和进一步研究奠定了基础。     

人血管生成抑制素基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

血管生成抑制素是新发现的一种血管生成抑制因子,能抑制肿瘤的生长和转移,有临床应用前景．根据血管生成抑制素是纤溶酶原的一个内片段的特点,以人纤溶酶原cDNA为模板,用PCR扩增出人血管生成抑制素基因,经序列分析后克隆至质粒pBV220转化大肠杆菌DH5α,在温度诱导下获得高效表达．SDS-PAGE及West-ern印迹分析显示：表达产物占菌体总蛋白的38％,相当于212mg／L,并具有免疫活性．生物活性分析结果表明,重组人血管生成抑制素能抑制bFGF诱导的CAM血管生成、抑制C57BL／6小鼠皮下原位B16黑色素瘤生长．     

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % ,表达产物为包涵体     

豌豆cop1cDNA的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥ｃｏｐ１ｃＤＮＡ为探针,从豌豆ＣＤＮＡ文库中克隆到了豌豆ｃｏｐ１ｃＤＮＡ。序列分析表明,它全长为２８６３ｂｐ,其中包括６０４ｂｐ５‘非编码区,２４３ｂｐ３’非编码区和２０１６ｂｐ编码区,编码６７２个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆ｃｏｐ１基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄３种植物ｃｏｐ１的序列同源性比较表明,ｃｏｐ１可能是一种进化上很保守的蛋白质。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术扩增得到来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因片段，并构建重组质粒pUC-T-GDH，然后将基因片段克隆于大肠杆菌表达载体pBV220中．得到表达质粒pBV-GDH．葡萄糖脱氢酶在含有表达质粒的基因工程菌株中得以诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描结果表明，经诱导表达的葡萄糖脱氢酶约占基因工程菌株总蛋白的45％．葡萄糖脱氢酶活力测试表明，基因工程菌株无细胞抽提液中葡萄糖脱氢酶的活力为7.8U／毫克，约为对照组的30倍．实验结果初步说明，广泛应用于工业化生产的葡萄糖脱氢酶可以在基因工程菌株中得以大量表达并维持较高活力．     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

Bti cryIVB基因的克隆及表达质粒的构建

采用ＰＣＲ方法,克隆得到３．５ｋｂ的开放阅读框架（ＯＲＦ）,其包括Ｂｔｉ的杀虫蛋白基因,ｃｒｙＩＶＢ结构基因各部分上游启动区。将结构基因亚克隆到高表达载体ｐＱＥ５２中,构建了高表达质粒ｐＱＥ５２Ｂ。在Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ）中,１３０ｋＤ的蛋白得到表达,其对韭菜迟眼蕈蚊（Ｂｒａｄｙｓｉａ ｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）三龄幼虫具有较强的毒杀作用。     

人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)穿膜蛋白基因片段克隆表达

以人免疫缺陷病毒２（ Ｈ Ｉ Ｖ２） 的原病毒基因组为模板,通过套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增得到了 Ｈ Ｉ Ｖ２ 的一段特异性膜抗原蛋白基因片段;随后将此片段克隆入诱导表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｘ５ Ｘ１ ,获得了重组表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｘ３６ Ｅ Ｎ Ｖ． Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 对重组表达菌株诱导后, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 结果显示重组菌株有特异性表达蛋白带产生     

钝齿棒杆菌YL_1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｍｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＹＬｌ的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实．共筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．９９％．从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹＩ９４，转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４－５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件．     

rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.     

人rabl3基因克隆和表达

以人的胚胎ｃＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法筛选获得ｒａｂ１３基因，并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３和原核表达载体ｐＧＥＸ、ｐＥＴ－１５ｂ和ｐＭＡＬ－ｃ２中，把ｒａｂ１３基因转染入牛肾上腺毛细血管内皮细胞（ＢＣＥ细胞）中，免疫荧光染色显示Ｒａｂ１３定位于ＢＣＥ细胞胞质内膜性细胞器上，在为ｒａｂ１３基因对膜通道调节功能的进一步研究打下了基础。     

蜡质芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及序列分析

利用pMD18-T克隆载体从蜡质芽孢杆菌菌株T—HW3中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因（AHL—lactonase，aiiA）。测序结果表明，该基因（GenBank登录号为DQ000643）由753个碱基组成，编码含有250个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质的推测的分子量为28kDa，等电点为4．235左右。核苷酸序列的BLAST分析结果表明，与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因（86％-99％）。     

甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝(Brassiaca oleracea)为材料，取幼叶分离mRNA，反转录合成cDNA，以cDNA第一链为模板，通过PCR扩增，获得甘蓝磷酯酶D(Phosphorate　Lipid　Dehydrolase，PLD)HKD2功能区的基因片段．对其进行Blast分析，结果表明，分离的目的片段核苷酸序列与Genbank中报道的甘蓝PLD基因相比同源率为99．7％，只有2个碱基发生改变．将得到的PLD基因片段插入植物表达载体pAT940，构建了PLD基因反义表达载体pATC—rPLD，为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础．