水稻矮化突变体G蛋白α亚基基因的结构和表达

利用γ-Co60辐射诱发水稻特光矮-2(Oryza sativa L.cv.TGA-2)产生变异,获得一种稳定遗传的新型水稻矮化突变体dwarf69.dwarf69和TGA-2及其杂交后代F1、F2、F3成熟期的株高数据表明矮化表型受一对隐性基因控制.进一步研究发现,虽然dwarf69和TGA-2的G蛋白α亚基基因(Rice G protein alpha-subunit,RGA)编码区核苷酸序列只有一个核苷酸的差异,但RGA在野生型TGA-2中的表达量明显高于在突变体dwarf69中的表达量.对矮化突变体dwarf69和野生型TGA-2的RGA基因5＇上游区的序列分析表明,dwarf69 RGA 5＇上游区比TGA-2RGA5＇上游区多出1076bp.首次报道水稻矮化突变体中的RGA5＇上游区序列与其野生种的RGA5＇上游区序列存在显著的差异.     

鸭跖草Commelina communis中差异表达cDNA 片段的克隆与分析

一种新的基因克隆技术称为抑制消减杂交技术(SSH)用于研究生长于2种生态环境(古铜矿山和正常土壤)中鸭跖草Commelina communis的基因表达差异.分别以Cu矿山鸭跖草作为检测子,非Cu矿山鸭跖草作为驱赶子,建立了生长于Cu矿山生态环境中鸭跖草的差异表达cDNA文库,此cDNA文库代表在Cu矿山鸭跖草中特异表达的cDNA.通过反式Northern杂交筛选出3个阳性克隆进行测序.序列分析表明其中一个cDNA为CaM-1ike基因.进一步对此基因进行Virtual Northern分析,结果初步表明此基因在生长于古铜矿山上的鸭跖草中上调表达.     

大蕉冷诱导差减文库的构建与分析

以低温处理的大蕉幼苗cDNA为检测子,未处理的大蕉幼苗cDNA为驱赶子,利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了大蕉幼苗冷诱导差减cDNA文库,通过点杂交差异筛选cD-NA文库,得到约50个低温下表达增强的候选克隆,对其进行DNA测序和同源性比较,发现获得的ESTs在功能上主要涉及信号传导、表达调控、非生物胁迫防御、蛋白质加工和能量代谢等方面。该SSH文库的构建为克隆大蕉抗寒相关基因奠定了基础。     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾差异表达基因的筛选与分析

通过双向cDNA RDA,即分别以敏感品系为检测子(tester)、抗溴氰菊酯品系为驱赶子(driver)和以抗溴氰菊酯品系为检测子(tester)、敏感品系为驱赶子(driver)筛选2种品系中的差异表达基因,初步分析小菜蛾敏感品系和抗性品系之间的遗传差异.经过3轮消减杂交后,将所得的差异片段克隆于PMD 18-T载体,氨苄筛选阳性克隆,经菌落PCR鉴定后送样测序.得到2条序列与GenBank数据库中的部分已知序列有一定同源性,其中1条序列与编码S3a蛋白基因有较高的同源性.     

通过差减文库筛选山羊羔肠道淋巴集结特异表达基因

羊羔肠道淋巴集合淋巴结（Peyer's patch，以下简称PP），是B淋巴细胞的主要来源地和发育、成熟场所，兼具中枢淋巴器官和周围淋巴器官的功能.采用抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建山羊羔肠道淋巴集结与其非PP肠壁组织的差减 cDNA 文库，以期找到在山羊羔肠道淋巴集结中特异表达的与免疫相关的基因. 分别从山羊羔PP与非PP肠壁组织提取总RNA，反转录成cDNA，以PP作为待检组织(tester)，非PP肠壁作为驱动组织(driver)，经过两轮杂交和抑制性PCR扩增，产物与T载体连接，经蓝白斑筛选，提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了两种组织间差异表达基因的差减cDNA文库. 对其中160个克隆测序，得到几个可能与免疫相关的基因，为进一步从中挑选和表达活性蛋白基因用于生产免疫增强剂奠定了基础.     

用差减cDNA文库筛选由热激导致的小鼠睾丸中差异表达的基因

采用抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）方法,构建正常和热激小鼠睾丸组织的差减 cDNA 文库,以期 筛选出小鼠生精过程中对热敏感的基因。分别从正常和热激小鼠睾丸组织提取总RNA,反转录成cDNA,以正常小鼠睾丸组织cDNA作为待检组织(tester),以热激小鼠睾丸组织cDNA作为驱动组织(driver), 经过2轮杂交和抑制性PCR扩增,产物与T载体连接,经蓝白斑筛选,提取质粒,经EcoRI酶切鉴定插入片段并测序,由此构建了2种组织间差异表达基因的差减cDNA文库。用半定量RT-PCR方法,进一步验证 了该文库中差减出的基因基本上为差异表达的基因。对随机挑选其中的932个克隆测序,对有效测序的565个基因序列与GenBank数据库中发布的序列进行同源性比较,大部分片段都可以检索到同源序列。 结果显示,cPGES/p23等13个基因热激后表达量上调;septin2等120个基因热激后表达量下调。其中cPGES/p23为本研究中首次发现的小鼠生精过程中对热敏感的基因。     

杨树黑斑病感抗无性系cDNA文库的构建

为了分离与抗病相关的目的基因,以病原菌接种后对黑斑病具免疫力的美洲黑杨I 69及黑斑病的高感无性系欧美杨I 45的叶片为材料,在利用荧光差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT PCR)获得抗病相关cDNA片段的基础上,用试剂盒及同样的植物材料构建了两个cDNA文库L45 72及L69 72。两文库的滴度分别为3.44×109pfu/mL及3.94×109pfu/mL,大于500bp的片段分别占96.67%和73.33%。     

抑制性差减杂交方法克隆重力适应相关基因

采用抑制性差减杂交方法,分别从经重力环境改变适应性锻炼（实验组）和未经重力环境改变适应性锻炼（驱动组）的两组SD大鼠的淋巴细胞中分别提取RNA和mRNA,并经逆转录酶合成dscDNA,经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分为2组,分别与两种不同的接头街接,再与驱动组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选80个克隆,通过斑点杂交,初步筛选出20个阳性克隆。     

人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

硬叶兜兰花芽SSH文库的构建

以硬叶兜兰花芽cDNA为Tester,营养芽cDNA为Driver,利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交(SSH)文库.通过PCR对文库中插入的片段进行检测后,筛选了288个插入片段为500bp以上的克隆进行测序.测序结果去除载体序列后聚类得到18条差异表达片段,用BLAST进行比对分析表明,这些差异表达基因所编码的蛋白与光合作用、合成代谢、基因调控等功能有关,其中包括多个转座子和反转录转座子的同源基因.     

Construction of human and mouse brain cDNA libraries and isolation of full-length cDNAs

cDNA libraries from aborted human 3-month fetal brain,adult rat and mouse brain were constructed by using a yZAP express cDNA library construction kin.Low molecular weight fragments of the second strand cDNASA were removed by flowing through the Sepharose CL-4B column and the frractionated long,Middle,Short fragments and the combined fragments weire respectively inserted into clone vectors to construct the cDNA libraries of the brain of human 3-month fetus.The 5'ends of 1200 clones from each of human fetal brain cDNA libraries were sequenced.A total of 894 ESTs were obtained and some full-length clones were squenced.By andalyaing the se-quences,12 novel full-length cDNAs were obtained.     

干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析

分别以1d干旱和7d干旱处理的开花期玉米顶叶cDNA为tester，正常生长的玉米顸叶cDNA为driver，利用抑制性差减杂交技术构建了两个干旱胁迫下开花期玉米消减文库．两个文库的重组率均高于95％，插入片段集中在300—600bp之间．对两个文库部分克隆进行测序发现，文库中含有脱水素、蔗糖合成酶、甜菜碱醛脱氢酶。DRE结合因子等大量的抗旱相关基因，说明两个干旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库已经构建成功。且具有重要意义．     

盐胁迫下盐藻特异表达基因片段的克隆

盐碱、干旱、极端温度等逆境条件是影响植物生长的重要因素。以抑制消减杂交及差式库的筛选对盐藻（Dunaliella salina)在高渗胁迫下特异表达基因片段进行了克隆。比较长期（1周,LS）及短期（16h,SS)NaCl胁近条件下基因表达情况,前者克隆到2个特异表达片段,后者也有2个。通过测序及Gene Bank中进行同源搜索,均未有可靠的同源性结果。可以初步认为,以上得到的4个cDNA可能是新基因或此片段不在保守区内。     

用于Roche/454高通量测序的12个多重标签转录组文库的构建

利用第二代测序技术测定海洋生物转录组已成为揭示海洋生物分子生物学机制的重要工具.以长度为10 nt的不同多重标签(multiplex identifier)进行区分,构建了 杂色鲍(Haliotis diversicolor)、僧帽牡蛎(Saccostrea cucullata)和亚心形扁藻(Platymonas subcordi ormis)3种海洋生物的12个多重标签转录组文库.以合适的比例对各文库进行混合,利用定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000等3种DNA浓度测定方法测定每个多重标签转录组文库的DNA浓度,3种方法的数值均一化并加权平均后,按照预定比例混合.为评估文库质量,先采用传统的Sanger测序测定了混合文库的192条序列,发现191条序列具有符合Roche/454高通量测序要求的AB格式,即一端为454A序列,另一端为454B序列;其中189条序列能分辨出其带有的多重标签;插入的平均长度为348 bp.然后通过Roche/454的滴定测序获得了34642条序列,其中32872条序列(94.9％)能分辨出其带有的多重标签,能够精确地分配到12个转录组,并且利用滴定测序结果计算出每个转录组文库的真实比例,对定量PCR、Qubit和NanoDrop-1000进行了评估,结果表明定量PCR是相对准确的定量方法.以上的评估表明所建立的转录组文库构建方法是稳定可靠的,可以广泛应用于转录组学研究.     

利用mRNA差异显示技术筛选绵羊毛性状相关基因

利用mRNA差异显示技术（DD-PCR）,比较绵羊肩、腹、腿三部位皮肤中mRNA的差异表达,共获得差异表达的cDNA片段16条,其中肩部、腹部与腿部之间的差异较大;对所有16条差异片段进行测序并在GENBANK中进行检索,未发现有同源序列.提示16条cDNA片段可能为未发现的基因片段,也可能存在假阳性片段.