鸭跖草Commelina communis中差异表达cDNA 片段的克隆与分析

一种新的基因克隆技术称为抑制消减杂交技术(SSH)用于研究生长于2种生态环境(古铜矿山和正常土壤)中鸭跖草Commelina communis的基因表达差异.分别以Cu矿山鸭跖草作为检测子,非Cu矿山鸭跖草作为驱赶子,建立了生长于Cu矿山生态环境中鸭跖草的差异表达cDNA文库,此cDNA文库代表在Cu矿山鸭跖草中特异表达的cDNA.通过反式Northern杂交筛选出3个阳性克隆进行测序.序列分析表明其中一个cDNA为CaM-1ike基因.进一步对此基因进行Virtual Northern分析,结果初步表明此基因在生长于古铜矿山上的鸭跖草中上调表达.     

食管癌表达上调基因EC45 cDNA的克隆

鉴别食管癌中差异表达的基因.利用抑制削减杂交和反式Northern高密度点杂交相结合的方法,获得一个在70%(18/26)食管癌中表达显著上调的基因,命名为EC45.通过放射杂交技术将其定位于3p12-3p11.2.通过筛选食管癌cDNA文库获得全长EC45cDNA(1987bp).EC45编码204个氨基酸,与核糖体蛋白l15的开放阅读框100%同源,但与5'非翻译区和3'非翻译区均无同源性.16种正常成人组织Northern杂交显示EC45均有表达,其转录本大小为2.0kb.以上结果提示:编码核糖体蛋白L15的EC45基因在食管癌组织中表达上调,在食管癌发生发展过程中可能发挥作用.     

RBM13 cDNA的克隆及其表达谱分析

从人胎脑cDNA文库中克隆到一条长3479bp的cDNA,它含一个长903bp的开放阅读框架,拟编码一个300个氨基酸的蛋白质,其分子质量为35397u,等电点为5．35,与酵母MAK16蛋白的同源性为41％,该编码蛋白有一个双侧核定位信号motif和一个RNA结合motif,将这一新cDNA序列推导的蛋白命名为RNA结合基序蛋白13（RBM13）,基因定名为RBM13,用RBM13基因的cDNA探针进行Northern杂交,检测到3．6kb和2．2kb二种长度的转录本。在心脏,骨骼肌,肾脏和肝脏中有较高表达。     

水稻矮化突变体G蛋白α亚基基因的结构和表达

利用γ-Co60辐射诱发水稻特光矮-2(Oryza sativa L.cv.TGA-2)产生变异,获得一种稳定遗传的新型水稻矮化突变体dwarf69.dwarf69和TGA-2及其杂交后代F1、F2、F3成熟期的株高数据表明矮化表型受一对隐性基因控制.进一步研究发现,虽然dwarf69和TGA-2的G蛋白α亚基基因(Rice G protein alpha-subunit,RGA)编码区核苷酸序列只有一个核苷酸的差异,但RGA在野生型TGA-2中的表达量明显高于在突变体dwarf69中的表达量.对矮化突变体dwarf69和野生型TGA-2的RGA基因5＇上游区的序列分析表明,dwarf69 RGA 5＇上游区比TGA-2RGA5＇上游区多出1076bp.首次报道水稻矮化突变体中的RGA5＇上游区序列与其野生种的RGA5＇上游区序列存在显著的差异.     

两个水稻MADS盒基因cDNA的克隆与分析

为研究水稻MADS盒基因与形态发生的关系,采用一个MADs盒基因家族保守区域特异的引物,运用RT-PcR方法,从水稻珍汕97B的幼穗中分离和克隆了两个新的MADs盒cDNA,命名为nmadsl和nmads3．基因序列分析表明,nmladsl和nmads3都含有植物MADS盒基因典型的MIK区结构,其中nmadsl属于MADS盒基因的GLO亚家族,nmads3属于AGL2亚家族．分子杂交实验发现,nmadsl和nmads3在水稻愈伤组织分化期和幼穗期活跃表达,在营养生长阶段的苗期表达受抑制,并发现处在同一发育阶段的水稻幼穗中,核质互作雄性不育系珍汕97A比其保持系珍汕97B多出了一个特异表达的nmadsl的基因产物。     

胎儿左右大脑差异表达基因片段的克隆

应用抑制性消减杂交（ＳＳＨ）技术从一２４ 周流产男性胎儿的左右大脑ｍ ＲＮＡ 中克隆到了４２ 个左脑特异表达基因的ｃＤＮＡ 片段，并随机挑选１５ 个克隆的测序结果与美国ＮＩＨ 基因库ＥＳＴ进行了同源性分析，同源性范围是６４％ ～１００％ ，其中有５ 个克隆的基因库同源序列与脑有关，其余１０ 个克隆同源于脑以外的其它组织．     

褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱羧酸酯酶基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为396 bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自铜绿蝇、家蝇、沟鼠、黑腹果蝇、线虫和埃及伊蚊的羧酸酯酶的片段存在高度同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,羧酸酯酶基因表达水平明显升高.以上结果表明,羧酸酯酶基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在有毒化学物质解毒及增强褐飞虱对抗性水稻的耐受性方面可能起着重要作用.     

褐飞虱谷胱苷肽转移酶基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

谷胱苷肽转移酶是昆虫体内重要的解毒酶系之一，研究水稻害虫褐飞虱的谷胱苷肽转移酶基因在褐飞虱与水稻互作中的表达变化，可为有效防治褐飞虱提供新的理论依据。利用反转录多聚酶链式反应（RTPCR）技术克隆了褐飞虱谷胱苷肽转移酶基因编码区的eDNA片段，并使用Northern杂交技术检测了该基因对两种不同抗性水稻的分子反应。结果表明，所克隆到的eDNA片段长度为201bp，该片段所编码的氨基酸序列与来自大劣按蚊、细小按蚊、冈比亚按蚊、果蝇和木瓜果实蝇的谷胱苷肽转移酶的片段存在高度同源性。Northern杂交显示，在褐飞虱取食抗性水稻后，谷胱苷肽转移酶基因表达水平明显升高，但褐飞虱取食感虫水稻TN1后，该基因的表达水平没有明显变化。     

牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建

肠激酶(Enterokinase,EK)是目前生物制药领域纯化重组蛋白产品时用于切割融合蛋白的首选工具酶之一．为克隆表达牛肠激酶催化亚基(EKL)编码的基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售肉牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT-PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCm-T载体中进行全序列分析．结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致．随后,将目的基因片段插入pET32a融合型表达载体中．经测序证实其重组DNA5’端多克隆位点与重组片段的接口处核苷酸顺序准确无误,所表达重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量为50kD,表达量达38％,为进一步进行Enterokinase催化亚基蛋白表达及活性研究奠定了基础．     

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.     

铝诱导普通野生稻(Oryza rufipogon L.)光合系统相关基因表达

采用抑制差减杂交技术对正常与铝毒处理的普通野生稻植株进行表达基因差异性分析，通过对差异表达基因的PCR选择性研究，阳性表达基因的测序、Northern杂交的进一步分析，得出3个cDNAs在铝毒处理的叶片中高效表达，其中2个与光合系统代谢相关，1个与花的发育有关，研究结果为更好地理解植物在铝毒胁迫下叶片相关基因表达提供思路，同时也为在野生稻这个丰富基因库中筛选出耐铝毒的重要基因，以便改良亲源较近的水稻适应日益酸化的土壤具有一定的意义。     

重金属镉处理的水稻幼根cDNA抑制差减杂交文库的构建

重金属污染是影响水稻生长和稻米品质的重要因素,其中又以镉(Cadmium,Cd)污染最为严重,然而目前对其分子机制以及解决措施却了解甚少。本研究以水稻品种日本晴为材料,采用0.5 mmol/L镉处理水稻幼根48 h,通过运用结合分子镜像选择(mirror orientation selection,MOS)技术的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法,构建cDNA抑制差减杂交文库,并进行microarray筛选,用于分离应答镉胁迫的差异表达基因。揭示水稻应对镉胁迫处理的分子机理,为水稻耐受镉胁迫基因的分离奠定了基础。     

水稻蔗糖转化酶基因的克隆及其功能的初步探讨

根据抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)方法分离到在水稻叶片中高表达的蔗糖转化酶基因片段，根据水稻基因组顺序设计引物分离到全长cDNA．测序结果表明该cDNA长度为1937bp，推测编码一个627个氨基酸的中性/碱性蔗糖转化酶．Alignment分析显示该推测蛋白质与已知的多个蔗糖转化酶具有很高的同源性．半定量PCR检测证实它在叶中的表达强于在根、花药和幼穗等组织中的表达，胁迫处理(盐和低温)使其表达上调．     

一个新的水稻矮秆突变体sd-sl的遗传与基因定位研究

新的矮秆基因的发掘、研究和利用对水稻育种和植物生长发育机制研究有重要的作用.用60Coγ射线辐照粳稻9522,获得一个能稳定遗传的突变体.该突变体表型为株高较野生型矮,叶片短而微卷.将该突变体与籼稻广陆矮杂交,F2代呈3∶1分离,说明该突变体受隐性单基因控制.通过InDel分子标记对F2代分离群体进行遗传定位,将该基因定位于第6染色体InDel标记OS604附近.随后又发展了多对有多态性的InDel分子标记,将该基因座位精细定位在InDel标记XL6-6和XL6-1之间,AP003490和AP005619上,两个引物之间的物理距离为118 kb.本研究为该克隆基因及其作用机理的探究奠定了基础.     

Identification of a protein associated with circulative transmission of Barley yellow dwarf virus from cereal aphids, Schizaphis graminum and Sitobion avenae

Using 2-D electrophoresis and virus overlay assay,a 50-kDa protein(P50)exhibiting specific binding to purified virus particles of BYDV-GAV was found in the protein extracts from Schizaphis graminum and Sitobion avenae,two aphid species transmiting BYDV-GAV.P50 in the extracts of S.graminum was isolated by preparation electrophoresis and electro-eluted proteins from the gel slices for antiserum preparation.After feeding the antiserum through membrane,the transmission efficiencies of S.graminum and S.avenae for BYDV-GAV decreased significantly.It was suggested that P50 should be related with transmission process.Location of P50 was found at the plasma membrane surrounding the accessory salivary gland(ASG) in the head tissues of S.graminum by immunogold-labelling experiment.The ascertainment of the protein associated with virus transmission has a significance influence on further understanding the transmission mechanism and genetic engineering for resistant to vector transmission.     

一个水稻抗纹枯病突变体的遗传分析及其基因的初步定位

高水平抗纹枯病突变体和高感纹枯病品种蜀恢881杂交构建分离群体,经F2分离世代的遗传分析,抗、感单株比例符合3 1(χc2=0.563,χ12,0.05=3.84),初步确定该突变体对纹枯病的抗性由一对显性主效基因所控制,命名为Rsb-2(t)。利用已合成的530对微卫星引物,对抗纹枯病突变体和蜀恢881进行多态性引物筛选,用多态性引物对上述F2分离群体的全部感病单株和部分抗病单株的DNA进行PCR分析,借助MAPERMAKER/EXP3.0软件,对其微卫星标记实验数据进行连锁分析,将Rsb-2(t)定位于第3染色体的p臂,发现RM218、RM251、RM4321和RM5748与Rsb-2(t)连锁,它们均位于着丝粒端,连锁距离分别为32.1 cM,41.1 cM,42.4 cM和49.7 cM。研究结果为进一步对该基因的精细定位奠定了基础。     

水稻S_5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料 ,构建了一个覆盖 9倍核基因组的cosmid文库 ,其平均插入片段约4 0kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC2 3D12的R末端为探针 ,从cosmid文库中筛选得到一个阳性克隆R2I19(～ 32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱 ,初步确定为S5区候选克隆。对该克隆的 2个TAC亚克隆TRW15 10 (～ 15kb)及TRW15 17(～ 15kb)进行了初步的生物信息学分析 ,证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性 ,并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

Identification of a novel tillering dwarf mutant and fine mapping of the TDDL（T） gene in rice （Oryza sativa L.）

Rice plant architecture is an important agronomic trait that affects the grain yield. To understand the molecular mechanism that controls plant architecture, a tillering dwarf mutant with darker-green leaves derived from an indica cultivar IR64 treated with EMS is characterized. The mutant, designated as tddl（t）, is nonallelic to the known tiilering dwarf mutants. It is controlled by one recessive nuclear gene, TDDL（T）, and grouped into the dn-type dwarfism according to Takeda＇s definition. The dwarfism of the mutant is independent of gibberellic acid based on the analyses of two GA-mediated processes. The independence of brassinosteroid （BR） and naphthal-3-acetic acid （NAA） of the tddl（t） mutant, together with the decreased size of parenchyma cells in the vascular bundle, indicates that the TDDL（7） gene might participate in another hormone pathway. TDDL（T） is fine mapped within an 85.51 kb region on the long arm of rice chromosome 4, where 20 ORFs are predicted by RiceGAAS （http：//ricegaas.dna.affrc. go.jp/rgadb/）. Further cloning of TDDL（T） will benefit both marker assisted selection （MAS） of plant architecture and dissection of the molecular mechanism underlying tillering dwarf in rice.