拟松材线虫两个HSP基因的克隆与分析

采用RACE(快速扩增cDNA末端)技术从拟松材线虫中克隆了HSP70蛋白编码基因mc2和HSP90蛋白编码基因mc19,两个基因的全长cDNA分别为2 067和1 222 bp。生物信息学分析结果表明：mc2基因的ORF为1 926 bp,推测的编码蛋白包含642个氨基酸,分子质量为170.85 ku,等电点为4.69。mc19基因的ORF为1 083 bp,推测的编码蛋白包含361个氨基酸,分子质量为97.70 ku,等电点为4.83。多序列比对和系统进化树结果分析都表明,拟松材线虫的mc2、mc19基因的编码蛋白与植物寄生线虫HSP70和HSP90蛋白具有较高的同源性,拟松材线虫和松材线虫之间的亲缘关系尤其密切。     

马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的生物信息学初步分析

本文根据马铃薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶类1基因的EST序列,运用多种生物信息学方法,对其进行初步的生物信息学分析.电子克隆获得了该基因的全长,结果表明:该序列全长1 742 bp,共编码357个氨基酸,有多个限制性酶切位点,有多个磷酸化位点,属于亲水性氨基酸,无信号肽,有膜穿透性.通过蛋白质二级结构功能域的预测,发现该序列中含有11个功能位点.通过蛋白质同源序列比对,发现该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因相似度极高,暗示该基因与番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因具有相似的生物学功能.以上结果可以为进一步研究该基因在马铃薯中特别是在抗青枯病分子育种中的功能提供相关依据.     

松材线虫性别决定基因Bx-sex-1表达特征和生物学功能分析

【目的】揭示松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)性别决定基因Bx-sex-1的表达特征和生物学功能。【方法】通过Mega 6中的Jones-Taylor-Thornton (JTT)模型,采用邻接法(neighbor joining,NJ)对Bx-sex-1和其他线虫的氨基酸序列进行系统发育构建。采用同步培养的方法分别收集不同龄期的松材线虫并提取总RNA,反转录获得cDNA并采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 的方法,研究Bx-sex-1在松材线虫不同发育阶段的相对表达量。同时采用qRT-PCR并通过绝对定量法分析Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组的拷贝数。采用dsRNA浸泡法对目的基因进行干扰,观察松材线虫后代卵的孵化率和雌雄比的变化。【结果】系统进化树显示松材线虫Bx-sex-1和其他两个植物寄生线虫成为一支,与自由生线虫和寄生动物线虫分别进化为不同的分支。松材线虫Bx-sex-1在不同发育阶段相对表达量有差异,在卵期相对表达量最高,而在2龄幼虫时期最低,从2龄幼虫时期到成虫时期相对表达量逐渐升高。qRT-PCR结果显示Bx-sex-1基因在雌虫和雄虫基因组中均为单拷贝。Bx-sex-1被干扰后,卵的孵化率下降,雌雄比降低。【结论】松材线虫Bx-sex-1基因在卵的发育过程和性别决定中可能具有重要作用。     

野桑蚕Ras 2基因的cDNA分子克隆及其特征

基于家蚕(Bombyx mori)Ras2基因的cDNA序列设计引物,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)Ras2基因,得到的cDNA序列长631bp,含有一个603bp的完整开放阅读框,由2个外显子和1个内含子组成,编码一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质的等电点为6.33,分子量为22.866kD.其氨基酸序列与其他昆虫Ras2氨基酸序列的同源性较高,且具有它们Ras2基因的典型特征.组织表达谱表明,该基因mRNA在野桑蚕的表皮、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中均有不同程度的表达.     

慈竹CCoAOMT基因的克隆及生物信息学分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶是木质素生物合成过程中的关键酶之一。该研究以慈竹嫩茎为材料,采用RT-PCR及RACE方法,克隆CCoAOMT基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明:1个慈竹CCoAOMT基因cDNA全长序列被成功克隆,该序列全长为1 080 bp,含有1个777 bp的读码框,编码了1个包含258个氨基酸的蛋白质,分子质量约为28.861 ku,等电点为5.33,二级结构中α-螺旋占42.25%,β-转角占8.91%,延伸链占15.89%、无规则卷曲占32.95%。对氨基酸多序列比对发现,慈竹与绿竹的CCoAOMT1基因亲缘关系最近,但慈竹CCoAOMT基因编码的氨基酸与绿竹相比,在第10位点上发生了缺失,5个位点发生了变异。慈竹、绿竹、毛竹、玉米CCoAOMT基因编码的氨基酸中都含有1个相对保守的无序化区域。NaC-CoAOMT1基因组织表达结果表明,其在未展开叶、笋上部和中部、茎的上部和中部的表达量较高。笔者将克隆并获得的慈竹木质素合成酶CCoAOMT基因全长序列(GenBank注册号为JF742462)命名为NaCCoAOMT1,分析认为其可能与慈竹木质素生物合成有关。     

大豆转录因子GmVOZ1的生物信息学及干旱胁迫表达分析

利用生物信息学的方法对大豆转录因子GmVOZ1进行了分析,同时利用实时荧光定量PCR对GmVOZ1在干旱胁迫下的表达量进行检测.GmVOZ1位于大豆基因组7号染色体上,mRNA编码序列全长1434 bp,编码含有477个氨基酸的蛋白质,分子量53.12 kDa,等电点5.87,其蛋白序列中含有一个VOZ-domain....     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

 通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列。同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895)。RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势。推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用。     

松材线虫毒力及发育转型与细胞自噬关系研究

采用透射电镜法对松材线虫的细胞自噬现象进行鉴认,并通过实时定量PCR的方法对不同毒力及不同发育期松材线虫的自噬基因BxAtg1和BxAtg8表达量进行测定。结果表明:饥饿诱导下不同毒力松材线虫存在细胞自噬现象,不同毒力松材线虫饥饿诱导12、24、36 h时,自噬基因BxAtg1表达量递减且趋势一致,而自噬基因BxAtg8在饥饿24 h时的强毒松材线虫体内表达量最高,在饥饿36 h时弱毒松材线虫体内表达量显著升高; 与繁殖性松材线虫体相比,自噬基因BxAtg1和BxAtg8在扩散型3龄(J_Ⅲ)和扩散型4龄幼虫(J_Ⅳ)中的表达量均增加,推测自噬活性的调节机制可能与松材线虫的毒力相关,与松材线虫发育转型阶段的形态特征联系,暗示自噬可帮助松材线虫发育转型,从而提高松材线虫的适应性。     

牙鲆fibrinogen β基因的克隆及表达分析

通过mRNA差异显示发现一个鳗弧菌刺激后在牙鲆肝脏中表达量显著增加的片段,结合RACE技术得到了该差异片段1 856 bp的全长cDNA,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码的蛋白质含有fibrinogen β的C末端签名序列.同源性分析表明其氨基酸序列与鱼类以及哺乳类的fibrinogen β都具有高度的相似性,因此可断定此基因为牙鲆的fibrinogen β基因(GenBank登录号为EF581895).RT-PCR分析表明,在注射鳗弧菌后,该基因在肝脏、肾脏、脾脏、腮、肠、心脏中的表达量呈现逐渐增加的趋势.推测其可能在鳗弧菌侵染中,起到了促进伤口愈合的作用,或通过和其他细胞因子结合在防御细菌的侵染中发挥免疫调节作用.     

西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆八氢番茄红素合成酶（PSY）基因的cDNA全长,用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,并用实时荧光定量PCR技术研究PSY在不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达情况.结果表明,PSY基因cDNA全长1 561 bp（GenBank登录号为KC166870）,其开放阅读框为1 266 bp,编码421个氨基酸.该基因及其推导的氨基酸序列与同为葫芦科的其他植物的PSY及氨基酸序列的同源性分别为87％和91％以上;序列分析显示,PSY氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列.不同瓤色西瓜果实发育过程中PSY的表达存在明显差异,红瓤果实中的表达量最高,这表明PSY可能与红瓤果实中积累较多的类胡萝卜素有关;PSY的表达量均高于PSY-A,推测PSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成.     

大豆GmNF-YA8的生物信息学及盐胁迫表达分析

本实验对大豆GmNF-YA8基因进行了生物信息学分析和高盐胁迫下表达量的检测.GmNF-YA8位于大豆基因组9号染色体上,cDNA全长1121 bp,开放阅读框615bp,编码204个氨基酸.GmNF-YA8蛋白分子量22.7 kD,pI 6.16.GmNF-YA8蛋白氨基酸序列中含有1个CBF保守结构域.GmNF-Y...     

中华按蚊CYP4G17基因的鉴定及生物信息学分析

基于中华按蚊(Anopheles sinensis)转录组,通过同源性搜索鉴定出一条中华按蚊CYP4家族序列,生物信息学分析将该基因命名为AsCYP4G17(GenBank登录号:KP004246),该序列全长1 962bp,其中编码区1 671bp,编码556个氨基酸。同源性分析表明该基因与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)CYP4G17氨基酸序列相似性最高:一致率为89%,相似率为94%。该基因编码的蛋白质相对分子质量为63.48kD,等电点为7.70。该蛋白第20~39位氨基酸为疏水区,蛋白质亚细胞定位显示该蛋白质位于细胞质中。基因结构分析显示,该基因含有两个相位2型内含子。研究结果为进一步揭示中华按蚊CYP4G17基因的功能奠定了基础,对阐明昆虫杀虫剂抗性机理具有一定的科学意义。     

野桑蚕Ras1基因的cDNA克隆及转录表达谱研究

采用RT-PCR的方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina Ras1基因,获得了其cDNA序列.该序列长640bp,含有1个579bp的完整开放阅读框,有2个外显子,1个内含子,编码1个由192个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为21 800和6.24.推导的氨基酸序列与其它物种Ras1基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的Ras1基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明该基因在野桑蚕的丝腺、脂肪体、表皮、中肠和马氏管中均有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕Ras1基因的功能奠定了分子基础.     

沙田柚WRKY转录因子的克隆与序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,差异分析得到沙田柚WRKY转录因子的序列。该基因的全长序列为1 178bp(GenBank accession No.KU173833),含有993bp的开放阅读框(ORF)可编码330个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为37.00ku,理论等电点为5.79。与未授粉的花柱相比,沙田柚异花授粉1、2、3d花柱中WRKY转录因子基因的表达量(RPKM)分别为5.67、26.04、17.08;而自花授粉1、2、3d花柱中WRKY转录因子基因的表达量(RPKM)分别为15.67、14.96、3.89。氨基酸序列分析表明,该氨基酸序列与甜橙、金桔的同源性分别为98%、97%。系统进化分析发现沙田柚WRKY转录因子与甜橙、金桔的亲缘关系很近,属于一个分支。     

东亚三角涡虫新基因Dj_UF-1功能分析

为进一步完善东亚三角涡虫(Dujesia japonica)基因数据信息,对东亚三角涡虫新基因Dj_UF-1进行生物信息学分析和表达水平检测.分析结果显示,该基因包含450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,Dj_UF-1蛋白分子量为17 179.8D,等电点为8.03.蛋白质三级结构预测发现Dj_UF-1与LYNX 1相似度较高.实时定量PCR结果表明,Dj_UF-1基因在东亚三角涡虫头部的表达量高于其在尾部的表达量.推测Dj_UF-1基因是东亚三角涡虫神经系统相关基因,Dj_UF-1为类LYNX 1蛋白.     

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR—RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为890bp，拟松材线虫rDNA—ITS区片段长度约为930bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切，结果表明：（1）DraⅠ酶切松材线虫群体均产生两个长度约510bp和380bp的片段，而拟松材线虫均不能被DraⅠ酶切；（2）所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaⅠ酶切；（3）用MspⅠ酶切松材线虫群体，除GZ02不能够被酶切外，其余样本能够产生两条长度分别为530bp和360bp的谱带。拟松材线虫群体，都能产生3条一致的亮带，长度分别为340bp、290bp、180bp；（4）所有松材线虫样本均不能被SalⅠ酶切，而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720bp和220bp的片段；（5）XhoⅠ酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520bp和370bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530bp和400bp的谱带。因此，内切酶DraⅠ、SalⅠ可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。     

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

利用RT-PCR方法,克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因,获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp,含有一个2 295bp的完整开放阅读框,有8个外显子,7个内含子,编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质,其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫(Laccase)基因相应氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.     

人SVOP基因的cDNA克隆及表达

SV2和SVOP都是大鼠中包含有12个跨膜结构域的突触小泡蛋白.笔者从人类大脑的cDNA文库中分离得到了一个类似于大鼠突触小泡蛋白SV2和SVOP的人类新基因的全长cDNA序列,它包含一个含有1 646个核苷酸的开放阅读框,编码一个含548个氨基酸的蛋白质.生物信息学分析表明:该基因定位在第12号染色体的12q24.12区域.Northern杂交结果表明:该基因只在人类大脑组织中表达,且与无脊椎动物线虫、疟蚊和果蝇的同源基因有50%的氨基酸同源性,与脊椎动物大鼠和小鼠的同源基因有90%以上的氨基酸同源性.     

松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90基因结构特征及其分子进化

转录组的多态性是探讨物种多样性与分子进化的重要方面。笔者选取物种间保守性较高的HSP70、HSP90蛋白作为研究对象,探讨二者在松材线虫和拟松材线虫基因组中的结构差异,探明他们在松材线虫和拟松材线虫中的特点,并试图揭示两种线虫的系统发育关系。结果表明二者内含子具有丰富的多态性,内含子中的G+C含量也显著不同。核酸序列gABG和gmc2分别编码松材线虫和拟松材线虫HSP70的642个氨基酸,相似性高达99%,仅存在9个氨基酸的差异,并且这种差异是由13个碱基的多态性造成的。gABO和gmc19分别编码松材线虫和拟松材线虫的HSP90,其氨基酸序列相似性为92%。对同义密码子的偏好性分析表明,17种氨基酸对应的58个密码子中,gABG和gmc2存在10个密码子差异,gABO和gmc19存在5个密码子差异。采用邻接法分别构建的系统进化树表明松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90在系统发育关系上最为接近,并与其他线性动物门物种高度同源。     

一个植物跨膜蛋白DUF872基因家族新成员的克隆与序列分析

DUF872家族是由一些未被具体描述的真核生物蛋白质构成,该家族的基因功能尚不清楚.本研究通过PCR方法从手掌参全长cDNA文库中筛选到了一个DUF872家族基因的全长cDNA,暂命名GcDUF872-1或Gc364.测序表明该序列长度为618 bp,推测编码103个氨基酸的蛋白质,序列比对表明它与拟南芥和水稻的DUF872家族基因蛋白质的相似程度达到85.92%.DUF872基因家族的进化分析表明Gc364与水稻、拟南芥的遗传关系最近,同属一个亚家族.半定量RT-PCR显示Gc364在植物组织中表达量较低,属于低丰度表达的基因,而且表达量受光处理而上调.生物信息学分析表明预测蛋白Gc364属于两次跨膜的蛋白质,可能是一个真正的编码蛋白,主要参与信号传递或能量的转换.