Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2), Streptomyces maritimus, Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454和Streptomyces sp.Tü4128)中分别被克隆.测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性.将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生.将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9.     

滑桃树种子提取物对其内生菌蛋白表达的影响

Streptomyces sp.WXC菌株是从滑桃树(Trewia nudiflora L.)种子中分离到的一株内生菌,滑桃树种子提取物对Streptomyces sp.WXC菌株的生长有促进作用.运用蛋白质组学方法,研究Streptomyces sp.WXC菌株在加入滑桃树种子提取物和不加入滑桃树种子提取物的两种条件下,其蛋白表达的差异,结果发现44个差异蛋白.经数据库比对分析,表明这些蛋白主要与菌株的运输、氧化还原、水解和生物合成有关.该结果为进一步研究植物与其内生菌的相互作用奠定基础.     

产谷氨酰胺转胺酶菌株的生理生化特征

以从土壤中分离得到的产谷氨酰胺转胺酶菌株H-197为研究对象,研究了其在固体培养基中的形态学、生理生化特性,初步鉴定其为链霉菌属(Streptomyces sp).同时研究了表面活性剂和抗氧化剂对酶产量的影响.结果显示,0.1%的PEG2000和1 mmol/L的GSH对酶的产生有一定的促进作用.     

聚乙烯降解菌白浅灰链霉菌LBX-2烷烃羟化酶基因SaalkB的克隆与表达分析

白浅灰链霉菌(Streptomyces albogriseolus)LBX-2能够高效降解聚乙烯(polyethylene, PE),而烷烃羟化酶alkB基因在聚乙烯降解中可能发挥重要作用.以LBX-2基因组为模板，利用PCR技术扩增SaalkB基因，该基因全长1 086 bp,编码361个氨基酸.对该基因编码蛋白进行生物信息学分析，发现AlkB蛋白包含5个跨膜结构域，无信号肽，属于亲水性蛋白，二级结构主要由无规则卷曲和α螺旋组成，与链霉菌Stretomyces sp.XY006的AlkB蛋白的同源性达100%.将克隆得到的SaalkB基因连接到表达载体pDE1上进行原核表达，且重组工程菌株能够降解PE. SDS-PAGE结果显示得到与预期蛋白分子量(40.9 kDa)大小一致的蛋白.利用荧光定量PCR发现，白浅灰链霉菌LBX-2在以PE为唯一碳源的培养基中SaalkB基因的表达量约为在高氏一号培养基中的30倍；蛋白质组学数据分析发现，白浅灰链霉菌LBX-2在以PE为唯一碳源培养48 h和84 h时，AlkB蛋白的表达量比在高氏一号培养基中分别上调了2.35和1.57倍，表明Saalk...     

四膜虫有性生殖过程中特异表达基因TCD3的序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了染色质结构的调节.本研究从嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)全基因数据库(www.ciliate.org)和基因表达数据库(tged.ihb.ac.cn)中筛选到有性生殖特异表达TCD3(Tetrahymena chromo domain-containing protein 3)基因.该基因ORF为1 005bp,大核染色体中基因全长1 241bp,含有两个内含子.5′-RACE和3′-RACE表明5′端非编码区(5′-UTR)长度为40bp,3′端非编码区(3′-UTR)长度为90bp.TCD3基因预测编码334个氨基酸构成,含有一个CHROMO结构域.CHROMO结构域聚类分析表明四膜虫Tcd3蛋白可能与线虫CeCDP功能类似,参与异染色质的形成和DNA序列删除.     

抗生素生物合成调控元件的功能解析

抗生素生物合成的整个过程由多个环节构成,受到前体物供给、装配、外运、调控和抗性等因素的影响,因此形成了相应的各种生物合成元件和模块。其中最为重要的是控制生物合成基因转录和翻译等表达水平的调控蛋白及其机制。放线菌的调控蛋白有全局性、多效性和途径专一性三种类型,并形成复杂的级联调控网络,对抗生素的合成实施严谨的控制。调控基因的功能鉴定和调控机理的解析是定向提高生物合成基因转录水平和抗生素产量的重要前提,也是构建抗生素高效合成的放线菌底盘生物的必要基础。在该研究执行的前两年,本研究重点对纳他霉素产生菌和天蓝色链霉菌的多个重要调节基因及其调控机制展开了深入的研究。抗生素生物合成途径优化的重要策略之一是提高生物合成基因及其编码蛋白的表达水平,因此,解析抗生素生物合成的调控机制是实施该策略的重要前提。该研究对恰塔努加链霉菌和天蓝色链霉菌中跟那他霉素、十一烷基灵菌红素和放线紫红素相关的多个途径专一性基因和多效性基因进行了功能鉴定,揭示了放线菌抗生素生物合成复杂而特别的调控机制,为途径优化和优良底盘生物的构建奠定了基础,而且通过调控基因的改造显著提高了抗生素的产量或缩短了发酵周期,已经初步显示出改造调节基因是提高抗生素产量的重要合成生物学策略。     

小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析

实验利用RT-PCR技术，在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋白基因的cDNA，并且含有完整的5′端，将该基因命名为Tufd1，利用RACE技术克隆了该cDNA的3′端。根据这2段cDNA克隆，设计特异引物，利用RT-PCR扩增出了Tufd1完整的开放读码框(ORF)，其编码区长948bp，编码315个氨基酸的多肽，在NCBI中运行BLAST。分析表明，Tufd1蛋白同拟南芥的UFD1蛋白有74％的同源性，在所编码的多肽链的N-端有UFD1保守结构域，可作为催化蛋白降解的信号。     

天蓝色链霉菌中S-adenosylmethionine依赖性甲基转移酶同源基因sco1162调控孢子发育及抗生素合成

利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pDZY101携带的转座子Tn101随机插入到天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M145构建的插入突变库,从中分离到一株孢子色素及抗生素合成明显发生变化的菌株BZ100.测序发现,该突变株中Tn101插入到了链霉菌的sco1162基因中.序列分析表明,该基因编码S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)依赖的甲基转移酶.为了验证该插入突变与表型的对应关系,构建了能在突变菌株中表达sco1162基因的互补质粒pFDZ16-1162,将该质粒转化突变株后,突变菌株的孢子形态和抗生素合成水平得到完全恢复.     

中华鳖tyrp-1基因的生物信息学分析

为阐明中华鳖酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)基因tyrp-1及蛋白质结构与性质,利用相关软件、数据库和方法对其进行了生物信息学分析.结果显示,基因转录本全长为2 829bp,编码535个aa.预测TYRP-1蛋白分子质量为60.16ku,理论等电点为5.35,为不稳定蛋白;N端含有信号肽,与信号识别蛋白结合后,促进其穿越内质网膜进入内质网腔;C端含有跨膜结构域,锚定于细胞膜上,发挥重要的生物学功能;TYRP-1蛋白含有2个铜离子结合结构域,与DCT蛋白有明显的相互作用.     

中度嗜盐菌GbsB基因的克隆、序列分析及生物信息学分析

为构建耐盐的转基因植物提供材料,根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisATCC 14580的GbsB基因的核甘酸序列设计1对特异性引物,通过PCR的方法扩增由分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsB基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,采用NCBI-BlastX软件在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:得到的GbsB基因的开放阅读框(ORF)全长为1209bp,编码1个由402个氨基酸残基组成的蛋白质;其与Bacillus licheni-formisATCC 14580的GbsB基因的氨基酸序列同源性高达96%。生物信息学分析表明:该GbsB基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个乙醇脱氢酶作用位点。     

人类线粒体转录终止样因子融合蛋白的构建与表达研究

在前期工作中,采用EST介导的定位克隆策略,克隆了一个人类线粒体转录终止样因子,为进一步研究其结构与功能的关系,构建了含该基因全长编码区的pET-28b的表达载体,经大肠杆菌中诱导表达获得含该基因的融合蛋白.用此融合蛋白注入小鼠制备多抗血清,为深入研究该基因的功能奠定了基础.     

木榄细胞膜Na~+/H~+逆向运输蛋白BgSOS1功能的初步验证

根据木榄BgSOS1的序列信息从木榄中克隆到了全长的BgSOS1基因,该片段包含1个3 462 bp的开放阅读框,可编码1 153个氨基酸的多肽.生物信息学的分析结果表明:该氨基酸序列所编码的蛋白与拟南芥、番茄、水稻、小麦、盐芥和杨树的SOS1蛋白高度同源,同源性分别为63.86%,66.61%,62.18%,60.19%,63.97%和75.97%;BgSOS1蛋白的N端含有12个跨膜的结构域,C端为1个较长的胞内结构域.尽管单个BgSOS1的表达并不能提高转基因酵母的抗盐性,但SOS1,SOS2和SOS3共表达的酵母,其抗盐性明显提高,这表明SOS2/SOS3蛋白激酶复合体可能通过调控BgSOS1的Na+/H+交换功能来提高木榄的抗盐机理.     

海洋放线菌S.areniocola CNS-205腺苷化结构域基因的克隆、表达和纯化

海洋放线菌S.arenicola CNS-205是首次报道的专属海洋性放线菌属Salinispora的代表菌株之一.选取海洋放线菌S.arenicola CNS-205非核糖体多肽合成酶氨基酸腺苷化结构域基因sare 0357,对其进行生物信息学分析后进行原核重组质粒的构建和表达及蛋白纯化.分别构建了pET-28a-sare 0357和pGEX-KG-sare 0357重组质粒,并转化E.coli BL21(DE3)进行不同诱导条件的诱导表达,sare 0357基因均以包涵体的形式表达.收集Sare0357重组蛋白包涵体,选取6mol/L的盐酸胍对其进行变性并将变性后的重组蛋白进行镍柱纯化.得到了可溶性的Sare0357融合蛋白.     

山羊KLF17基因克隆与组织表达

克隆山羊Krüppel样因子17基因(KLF17)的c DNA序列,并检测其组织表达水平,为KLF17基因的功能研究奠定基础.随机选取2~3周岁的健康简州大耳羊和藏山羊羯羊各4只,屠宰采集山羊不同组织样品(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮下脂肪),提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊KLF17基因序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)法检测KLF17基因mRNA的表达水平.结果表明,克隆得到山羊KLF17基因c DNA序列1 450 bp,包含CDS区全长858 bp,5'UTR序列12 bp,5'UTR序列580 bp,编码285个氨基酸残基.其CDS区与牛、绵羊相比在5'端少99 bp,而在531位多出361 bp,这导致其编码区在858位提前终止.山羊蛋白序列较牛、绵羊少113个氨基酸残基.组织表达结果显示,KLF17基因在藏山羊肺中具有最高的表达水平,而在简州大耳羊皮下脂肪中具有最高的表达水平.两种山羊均在背最长肌中具有最低的KLF17表达量.这些结果表明KLF17可能在山羊脂质代谢过程中具有重要调控作用.     

羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析

克隆羊草VHA-c基因并预测其编码蛋白质结构和功能.由羊草总RNA经RACE克隆获得VHA-c基因cDNA,采用生物信息学方法预测蛋白结构和功能.获得羊草VHA-c基因cDNA,命名为LVAP1基因(GenBank登录号为GQ397276),LVAP1基因开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸,有4个α-螺旋跨膜结构域,在第4个结构域上含有一个高度保守的G lu142残基,推测它是质子的结合位点.进化树分析显示,羊草LVAP1蛋白与小麦、碱蓬和冰叶日中花等植物的VHA-c蛋白具有高度的同源性,推测LVAP1亚基与其他VHA-c亚基执行相似的功能.     

乌塌菜叶绿素降解代谢调控相关基因BcNYE1的克隆和分析

采用电子克隆策略结合RT-PCR从乌塌菜中分离得到了AtNYE1的同源基因BcNYE1完整编码区序列,并对其进行基因组组成和功能研究.BcNYE1的开放阅读框(ORF)长870 bp,编码289个氨基酸残基;基因组序列全长为1 132 bp,有2个内含子和3个外显子.为了验证BcNYE1基因的功能,构建了植物双元表达载体pCHF4-BcNYE1,采用冻融法导入农杆菌GV1301,通过花蕾浸染法转化拟南芥滞绿突变体nye1-1.对所获得的卡那霉素抗性植株进行PCR、RT-PCR检测,结果表明,在得到的转基因株系中,BcNYE1基因已整合到受体植物基因组中,并且可以转录成mRNA.互补实验结果显示,BcNYE1基因不具备互补拟南芥滞绿突变体nye1-1叶绿素降解缺陷的功能.     

拟穴青蟹β-肌动蛋白基因的克隆与分析

β-肌动蛋白广泛存在于真核生物中,在维持细胞结构、细胞运动和细胞分裂等生理活动中发挥着重要作用.运用RACE技术克隆了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)β-肌动蛋白基因,并用RT-PCR方法检测该基因在成体各组织中的表达情况.拟穴青蟹β-肌动蛋白cDNA全长1 337 bp,5′端非编码区为67 bp,3′端非编码区为139 bp,开放阅读框1 131 bp编码376个氨基酸.拟穴青蟹β-肌动蛋白与其他节肢动物β-肌动蛋白氨基酸序列的相似性高达98％～99％.系统进化树显示拟穴青蟹β-肌动蛋白基因的分子进化地位与其生物学分类地位一致.半定量RT-PCR分析结果表明,β-肌动蛋白基因在拟穴青蟹视神经节、脑神经节、胸神经节、性腺、鳃、心、胃、肌肉、肝胰腺共9个组织器官中的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

Bacillus sp.XJ1-05菌株GbsA基因的克隆及其生物信息学分析

根据地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因(GeneID:3027576)的核甘酸序列设计1对特异性引物.通过PCR的方法扩增由本实验室分离的中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05的GbsA基因,经T/A克隆,插入到pBS-T载体上进行序列测序,结果表明得到的GbsA基因的开放阅读框(ORF)全长为1473bp.在Genbank数据库中进行同源性检索,结果表明:其与Bacillus licheniformis ATCC 14580的GbsA基因的氨基酸序列同源性高达97%.生物信息学分析表明:该GbsA基因编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,高亲水性,有2个醛脱氢酶作用位点.     

对氨基苯甲酸生物合成基因pabAB的缺失对抗生素FR-008生物合成的影响

抗生素FR-008是由链霉菌FR-008产生的一种七烯大环内酯类抗真菌抗生素,它以对氨基苯甲酸(PABA)为起始单位,在I型聚酮合酶(PKS)的催化下合成聚酮内酯环.前期生物合成基因簇序列测定发现了可能的对氨基苯甲酸生物合成基因(pabAB),编码4-氨基-4-脱氧-分支酸(ADC)合成酶.通过同框缺失实验获得pabAB发生缺失的基因置换突变株BLQ-1并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增进行了验证.高效液相色谱(HPLC)分析和生物测定证实突变菌株BLQ-1丧失了合成抗生素FR-008的能力.这种产量的丧失可以通过回补克隆的pabAB基因或喂养外源PABA得到回复.实验证明,pabAB负责对氨基苯甲酸的合成,是抗生素FR-008生物合成的必需基因.