人酸性成纤维细胞生长因子突变体表达与修饰

采用聚合酶链式反应(PCR)法将人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)基因中编码第98位和第132位半胱氨酸(Cys)的密码子突变为编码丝氨酸(Ser)的密码子,构建重组质粒pET3c-haFGF Ser98,32,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达率达到23．48％．用MTT法测定产物的活性,发现haFGF Ser98,132突变体的比活与天然haFGF相似．采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)5000-马来酸酰亚胺酯定点修饰第31位Cys,修饰率达到30％以上,修饰产物的比活性保留55．53％．     

大肠杆菌guaC基因的克隆及高效表达

以E.coli MC4100染色体DNA为模板使用PCR扩增技术克隆了鸟苷酸还原酶基因guaC，该基因全长1044bp，编码相对分子质量为37ku的蛋白质。将该基因直接克隆于PET—16b质粒的T7启动于下游，得到质粒pEXP1。转化E．coli BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明，鸟苷酸还原酶的活性为不含质粒的宿主菌的80-85倍。     

白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析

通过分析多种已知的毒蛇蛇毒类凝血酶（SVTLEs）基因序列同源性，以保守的N和C末端氨基酸序列设计引物，克隆得到白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris）SVTLE基因并分析其序列。以毒腺总RNA为模板进行RT—PCR，纯化并克隆至pMD18-T。结果表明，该酶基因大小为777bp；推测出其相应氨基酸序列含258个氨基酸残基，分子量为28．02kD，pI值为6．07；其3个可能糖基化位点为NDT103～105、NNS121～123和NRT251～253；与其它毒蛇的已知SVTLEs基因比较分析，推测出其含6对二硫键即Cys31—162、Cys50-66、Cys98．256、Cys142—210、Cys174—189和Cys200—225；其催化活性中心氨基酸残基为His65、Asp110和Ser204。分子进化树分析表明，毒蛇SVTLEs一级结构的进化具有一定种属特征，可为蛇的系统分类提供参考。     

口蹄疫病毒抗原表位的编码序列在大肠杆菌中表达

为在大肠杆菌和牛分枝杆菌 BCG中表达口蹄疫病毒 ( Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV) O、A、C三种血清型抗原表位的编码序列 ,我们优化筛选了这三种血清型主要抗原表位的序列 ,设计合成了其编码 DNA序列 ,并将此序列克隆到细菌表达载体 p QE4 1中 ,转化大肠杆菌 M1 5 [p REP4 ],经 IPTG诱导 ,在 SDS-PAGE中得到 34 k D的小鼠二氢叶酸还原酶( DHFR)基因与 FMDV的三型抗原表位编码序列的融合表达的蛋白质带 .     

极谱法测定铕(Ⅲ)与有机磷酸、丝氨酸和半胱氨酸三元配合物的稳定常数

用极谱法研究了铕与有机磷酸 (P)、丝氨酸 (Ser)、半胱氨酸 (Cys)等形成的二元体系Eu3 P、Eu3 Ser、Eu3 Cys和三元体系Eu3 P Ser、Eu3 P Cys.考察了各种配合物形成的条件、电化学性质 ,测定了配合物的组成及其稳定常数 .结果发现 ,其稳定常数随有机磷酸烷基取代基的增大而减小 .     

耐热、高产重组人Cu,Zn-SOD改构体的构建及纯化方法的研究

目的通过对天然人Cu,Zn-SOD基因的改造,得到热稳定性、活性产量提高的重组人Cu,Zn-SOD(rhCu,Zn-SOD)改构体,并进行蛋白纯化方法的研究。方法重叠PCR技术将天然hCu,Zn-SOD的Cys6突变为A la6,Cys111突变为Ser111,构建重组质粒pET22b-rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE分析改构体蛋白的表达,并进行W estern blot鉴定;研究改构体蛋白的纯化方法,HPLC检测蛋白纯度,比较rhCu,Zn-SOD及其改构体的活性和热稳定性。结果成功构建了rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser表达载体;SDS-PAGE显示rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser蛋白在BL21(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量占菌体蛋白总量的64.6%;Western blot结果显示表达产物可以特异性地与小鼠抗人SOD多克隆抗体结合;纯化得到纯度大于95%的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Se改构体蛋白,从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍;改构体的热稳定性较未改构体获得大幅提高。结论构建的rmhCu,Zn-SOD6A la,111Ser改构体具有较好的热稳定性和较高的活性产量,摸索出一种比较简易的蛋白纯化工艺,为Cu,Zn-SOD的广泛应用奠定基础。     

鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

研究以AFB1-BSA免疫的小鼠脾脏细胞为试验材料,利用RT-PCR技术,克隆了抗AFB1抗体重链和轻链可变区基因VH和VL,利用连接肽(Gly4Ser)3将VH和VL链接成单链抗体基因scFv,通过噬菌体展示载体pCANTAB-5E携带将其电转化E.coli TG1,经氨苄青霉素平板筛选,构建了库容为2.13×109 cfu/μg DNA的噬菌体单链抗体库,抗体库的克隆阳性率达到100%,且多样性良好,为高活性抗AFB1单链抗体的筛选提供了材料基础。     

染色体步移法克隆Pandoraea sp. BD-33硝基苯硝基还原酶基因

硝基还原酶是一种对辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)以及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性还原酶,本研究克隆的硝基苯硝基还原酶NN-BD-33是其中一种,它依赖于NADPH,以硝基苯维底物催化降解硝基苯成羟基苯胺,同时辅酶NADPH被氧化为NADP+。以公开报道的硝基苯硝基还原酶同源序列为参考,通过染色体步移法从Pandoraea sp.BD-33菌株中克隆得到硝基苯硝基还原酶基因。将为进一步深入研究硝基苯硝基还原酶的蛋白三维结构和作用机理奠定基础。     

感染性嵌合病毒SHIV cDNA的构建及活性筛选

以感染性克隆SHIV-KB9 cDNA为主要骨架，将其env基因区域的gp120和部分gp41(从N末端的50到650个氨基酸)的1．7kb片段，用来源于4个不同中国HIV-1 B’／C毒株env的相应区域进行替换，构建了50个全基因SHIV cDNA克隆，大规模体外活性筛选实验，获得了能够在人的PBMC中进行生产性复制的SHIV-XJ02170 cDNA克隆．     

A链链内二硫键移位突变胰岛素原的构建与表达

采用定点突变技术,将人胰岛素原基因编码框中A11位氨基酸残基与A12位氨基酸残基进行了互换,构建了[CysA11Ser,SerA12Cys]人胰岛素原突变基因.在大肠杆菌原核表达系统中对突变体基因进行了表达,并对表达产物进行了变复性研究及初步的分离纯化,获得了具有稳定结构的突变体蛋白质,探讨了突变体A链链内二硫键的形成状况,为进一步深入揭示A链链内二硫键的角色与功能打下了基础.     

氨基酸定点突变碱性成纤维生长因子的稳定性

为了提高碱性成纤维生长因子的体外稳定性,分析比较了野生型人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）和半胱氨酸（Cys）定点突变型hbFGF的生物活性、肝素结合能力、体外聚合程度和聚合成分,以及两种蛋白单体的表面静电分布和溶剂可及表面面积．结果表明,突变型hbFGF保持了野生型hbFGF的生物活性以及肝素结合能力,并显著了降低了体外聚合程度,而单体三维结构中的静电分布和溶荆可及表面面积变化不明显,由此可见,Cys突变影响了hbFGF的共价聚合,而对非共价聚合影响不大．     

化学修饰对川泽泻凝集素生物学活性和构象的影响

用特异性化学修饰和荧光光谱的方法分析川泽泻凝集素(APL)活性位点氨基酸的分布情况.研究结果发现,色氨酸的化学修饰使活性降低80%,统计出每分子APL含有2个色氨酸残基,一个色氨酸位于凝集活性中心,另一个位于分子表面的疏水袋中,与凝集活性无关.精氨酸的化学修饰使活性降低50%,半胱氨酸的化学修饰使活性完全丧失.天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸等化学修饰后凝集活性无明显变化.表明色氨酸、精氨酸和半胱氨酸对凝集素的凝集活性中心的构成起重要作用,天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸等氨基酸位于凝集素的凝集活性中心附近,只是在维持凝集素分子的构象上具有一定的作用.     

Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice

The mouse mutant mnd2 (motor neuron degeneration 2) exhibits muscle wasting, neurodegeneration, involution of the spleen and thymus, and death by 40 days of age. Degeneration of striatal neurons, with astrogliosis and microglia activation, begins at around 3 weeks of age, and other neurons are affected at later stages. Here we have identified the mnd2 mutation as the missense mutation Ser276Cys in the protease domain of the nuclear-encoded mitochondrial serine protease Omi (also known as HtrA2 or Prss25). Protease activity of Omi is greatly reduced in tissues of mnd2 mice but is restored in mice rescued by a bacterial artificial chromosome transgene containing the wild-type Omi gene. Deletion of the PDZ domain partially restores protease activity to the inactive recombinant Omi protein carrying the Ser276Cys mutation, suggesting that the mutation impairs substrate access or binding to the active site pocket. Loss of Omi protease activity increases the susceptibility of mitochondria to induction of the permeability transition, and increases the sensitivity of mouse embryonic fibroblasts to stress-induced cell death. The neurodegeneration and juvenile lethality in mnd2 mice result from this defect in mitochondrial Omi protease.     

Crystallographic analysis of mutant human haemoglobins made in Escherichia coli

The expression of beta-globin in Escherichia coli has enabled us to study the functional role of individual amino-acid residues in haemoglobin (Hb) by site-directed mutagenesis. In contrast to mammalian Hbs, some teleost fish haemoglobins show a drastic lowering of oxygen affinity and cooperativity at low pH, a phenomenon known as the Root effect. We have produced the two mutant haemoglobins Hb Nymphéas [Cys(F9)93 beta----Ser] and Hb Daphne [His(H21)143 beta----Arg, Cys(F9)93 beta----Ser] to investigate this allosteric property. Although these substitutions were thought to be responsible for the Root effect, Hb Nymphéas and Hb Daphne show an increased oxygen affinity and a reduced effect of pH on oxygen affinity. Our X-ray crystallographic studies show that the hydroxyl group of Ser 93 beta forms a hydrogen bond with Asp 94 beta which is in equilibrium with the salt bridge between Asp 94 beta and His 146 beta. The oxygen-binding properties of Hbs Nymphéas and Daphne are accounted for by the partial disruption of the salt bridge.     

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.     

新型T+1断裂蛋白质内含子的构建

首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子分别为半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)时均具有剪接活性.所获的两类具有剪接活性的T+1型断裂蛋白质内含子具备一定的插入位点通用性,这一特点为蛋白质反式剪接技术在蛋白质工程领域广泛应用提供了新的契机.