含5′-磷酸吡哆醛(辅因子)的酶的固定化

辅因子—5′-磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate简称PLP)在酶促反应中具有重要的作用。Weetall和Ikeda等分别用PLP与琼脂糖联接进行固定化各种含PLP的酶和直接用琼脂糖来固定化含PLP的酶的研究。本文在前文的基础上,把固定化PLP用于谷氨酸脱羧酶及谷丙转氨酶的固定化,并对其结构功能的相互关系进行探讨。     

固定化谷氨酸脱羧酶转化γ-氨基丁酸的研究

研究卡拉胶制备固定化谷氨酸脱羧酶及转化γ-氨基丁酸(GABA)的最适条件.以本实验室研发的诱导剂对构建的表达谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因工程菌进行诱导,并利用卡拉胶对获得的粗酶液进行包埋制备固定化酶,对影响GAD固定化效果和GABA产量的因素进行研究.最佳固定化条件为卡拉胶浓度1.5%,氯化钾浓度3%,硬化时间2 h;转化GABA的最适条件为反应最适pH为3.8～4.3,最适温度为37℃～43℃,将制得的固定化谷氨酸脱羧酶(IGAD)重复使用7次后,催化活力仍保持在最初值的75%;IGAD在最适底物浓度60 mmol/L下反应时间2 h后谷氨酸转化率达99%,利用IGAD进行连续催化反应,最终GABA摩尔转化率为70.98%,晶体得率为91.90%,晶体纯度94.73%.该法具有较好的操作稳定性和较高的底物转化率,为连续化制备γ-氨基丁酸提供参考.     

固定化原生质体产谷氨酸脱氢酶的研究

本文介绍了用海藻酸钙凝胶固定化谷氨酸棒杆菌T_(6-13)原生质体生产谷氨酸脱氢酶GDH,Eel.4.1.4的研究。固定化原生质体培养72h后发酵液中GDH活力可达到1.64×~(-2)U/mL,为游离细胞内产酶的205%.固定化原生质体还可用溶菌酶处理固定化细胞而制得,与直接制得的固定化原生质体具有同样的产酶能力,且制备方便,可重复使用,具有良好的贮藏稳定性。     

生物传感分析仪在共固定化酶中的应用研究

本文研究了生物传感分析仪在共固定化GOD-CAT树脂的过氧化氢(H2O2)质量浓度的测定和酶活力的表征中的应用。首先,采用过氧化氢电极法检测了反应液中过氧化氢的质量浓度,过氧化氢由不同GOD/CAT酶活比条件下制备的共固定化GOD-CAT树脂催化氧化葡萄糖生成,从而找出了最适的GOD/CAT酶活比;然后,采用葡萄糖氧化酶电极法检测了催化氧化过程中反应液中底物葡萄糖质量浓度的变化,提供了一种共固定化GOD-CAT树脂的活力表征方法,并以此为基础研究了共固定化GOD-CAT树脂的酶学性质。结果表明,共固定化GOD-CAT树脂的最适GOD/CAT活力比是1:1;共固定化酶的最适温度是45℃,最适pH值为6.0,其热稳定性、pH稳定性、操作稳定性及贮存稳定性较游离酶均有一定的提高。     

固定化乳酸脱氢酶的催化性质研究

研究了固定化乳酸脱氢酶(LDH)的制备和催化性质,讨论了戊二醛体积分数、酶的偶联时间、pH值对酶固定化的影响.对游离酶和固定化酶催化性质的研究结果表明:酶促反应最适pH分别为9.2和10.2,最适温度分别为51℃和50℃,米氏常数分别为16.2 mmol/L和0.7 mmol/L.与游离酶相比,固定化酶的活力稳定性更佳,有更好的贮存稳定性和复用性.     

交联海藻酸钙凝胶固定化酵母醇脱氢酶研究

对用海藻酸钙包埋、戊二醛交联法固定酵母醇脱氧酶催化苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸的过程进行研究,比较游离酶与固定化酶的酶学性质.实验结果表明:固定化酶的热稳定性显著提高,游离酶在70℃时酶蛋白变性失去活力,而固定化酶在65℃保温1 h的能保持64%的酶活力,在70℃时酶活力仍町保留48.6%;固定化酶的最适温度由30℃升至40℃,最适反应pH值由6.8下降为5.8;固定化酶保留了62.72%的游离酶活性, 固定化酶的表观米氏常数和最大反应速率分别为37.33 mmol/L和358.42 nmol/min.该固定化酶具有良好的储存稳定性和操作稳定性.     

5′-磷酸吡哆醛高分子衍生物的辅酶功效

5′-磷酸吡哆醛(PLP)与经β-硫酸酯乙砜基苯胺活化的聚乙二醇(PEG)或右旋糖酐(Dx)共价结合,得可溶性5′-磷酸吡哆醛衍生物。用PLP-PEG和PLP-Dx衍生物代替PLP作为谷氨酸脱羧酶的辅酶,谷氨酸脱羧酶活力回复率达18%左右;用甘氨酸封闭的PLP-PEG代替PLP作为辅酶,谷氨酸脱羧酶活力回复率达44%。     

醛基化大分子强化介孔泡沫硅中青霉素酰化酶和胰蛋白酶的固定化

为了提高酶的亚基增强固定化酶的稳定性,在介孔泡沫硅中对固定化酶进行共价修饰.以青霉素酰化酶和胰蛋白酶为目标酶,考察醛基化修饰对固定化酶活力、负载率的影响以及在酸性缓冲溶液、亲水有机体系和离子液体中的催化稳定性,并对固定化酶进行电泳分析.结果表明:醛基化修饰的青霉素酰化酶在酸性缓冲液中6h保留95%的残余活力,在疏水离子液体中50℃处理10h保留近80%的残余活力;醛基化胰蛋白酶在20%乙醇中50℃保持活力不变.因此,醛基化修饰能稳定酶的亚基,在创建酶催化的微环境的同时,又能提高酶在极端环境下的稳定性.     

固定化蛋白酶区域选择性催化合成蔗糖己二酸单乙烯酯

用固定化蛋白酶FG-F在有机溶剂中催化蔗糖和己二酸二乙烯酯(DVA)合成了蔗糖己二酸单乙烯酯.用吸附法以硅藻土为载体研究了蛋白酶FG-F的固定化.固定化条件优化为:pH值8～10,温度为20～40℃,磷酸盐缓冲溶液的浓度范围为0.02～0.06 mol/L,酶与硅藻土的质量比为1:6.固定化酶在含水量为0.25%的DMF中,于45℃,220 r/min,pH值为8时,转酯化催化活力最高.转酯化反应3 d,DVA生成2-0-己二酸单乙烯基蔗糖酯的转化为52%.     

表面活性剂改性膨润土固定化脂肪酶的初步研究

表面活性剂改性载体影响酶的催化活性,为此,考察了复合表面活性剂改性膨润土对固定化酶特性的影响,以阳—阳离子表面活性剂、阳—阴离子表面活性剂、阳—非离子表面活性剂分别对钠基膨润土(Na-Bent)进行改性,通过吸附法对褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)进行固定化,制备复合表面活性剂改性膨润土固定化酶。以橄榄油水解反应表征酶活性,对比不同的复合离子表面活性剂改性膨润土固定化CRL酶的结果发现,由十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和曲拉通100(TX100)复合离子表面活性剂改性膨润土制备的固定化酶(CTAB/TX100-Bent-CRL)的比活回收率可达到292. 8%,相较于游离酶CRL,其催化活性得到改善。催化特性研究表明:CTAB/TX100-Bent-CRL的最适反应温度和p H值分别为40℃和7. 0,与游离酶ORL相比,固定化酶的耐受性和储藏稳定性均得到改善,在温度为20℃～60℃、p H 5. 0～9. 0范围内均能发挥较好的催化性能。在温度为60℃的反应条件下,CTAB/TX100-Bent-CRL仍能保持最适温度条件下活力的89. 0%。在4℃下储藏15 d后,固定化酶仍能保持初始活力的59. 7%,而Na-Bent-CRL和游离酶CRL的残留活力分别为45. 7%和33. 3%。     

[BMIM]PF_6/缓冲液两相体系中固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.     

PF6/缓冲液两相体系中固定化 β-葡萄糖醛酸苷酶催化特性研究

利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系为介质,固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),以期改善酶催化效能.实验表明,当反应条件固定化酶为0.25g,两相体系中[BMIM]PF6的体积分数为35%,pH为5.0,反应温度为40℃时,酶活力最高达1 000U,远大于纯缓冲液单相体系中的最高酶活力450U.离子液体重复利用实验表明,[BMIM]PF6回收率高于85%,在含有重复回收的[BMIM]PF6介质中,固定化酶相对活力大于93%.     

大孔疏水载体的制备及其在脂肪酶固定化中的应用

以苯乙烯(St)为功能单体,二乙烯基苯(DVB)为交联剂,采用固液联合致孔的方式,制备了疏水多孔载体。将多孔载体用于脂肪酶Candida sp.99-125的固定化,得780U/g的固定化活力。固定化使酶在30～50℃范围内热稳定性得到了明显的提高,最适反应温度提高了5℃,在pH6.0～9.0范围内酶的相对活力有所提高,最适pH不变仍为8.0。固定化酶单次催化油酸和十六醇的酯化率达98%,其操作稳定性好,连续间歇操作15批,酯化率仍可达到50%。     

固定化氨基酰化酶性质的研究

1、米曲氨基酰化酶吸附于DEAE—萄聚糖凝胶制得固定化酶。2、考察了固定化酶的一些性质。固定化对氨基酰化酶的温度—活力关系没有影响;固定化酶的表观米氏常数与天然酶的米氏常数差别也不大;固定化酶的热稳定性提高5℃。3、固定化酶及天然酶水解乙酰—DL—色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸速度较快,缬氨酸、丙氨酸和α—氨基丁酸的衍生物居中,非天然氨基酸对甲氧苯乙氨酸的衍生物最慢。4、比较了固定化氨基酰化酶柱式法与分批法降解乙酰—DL—α—氨基丁酸的运转情况,表明酶柱在45℃,169小时运转过程中,能稳定地拆分底物。     

固定化脂肪酶的动力学研究

以壳聚糖为载体,用物理吸附固定化脂肪酶,对影响固定化过程的各种因素进行了考察,确定了最优条件,并比较了游离酶和固定化酶的最适温度、pH、酶的热稳定性以及表观Km。固定化酶水解的最适pH(pH7．0)稍低于游离酶(pH8．0),最适温度为50℃(游离酶为40℃)。固定化酶在50℃的半衰期(0．96h)是游离酶(0．32h)的3倍,在4℃的冰箱中贮存3个月活力变化很小。     

聚乙烯醇包埋固定Burkholderia cepecia JS-02细胞的研究

用聚乙烯醇(PVA)凝胶包埋固定法对Burkholderia cepecia JS-02细胞进行了固定化,所得凝胶具有良好的机械性和稳定性.固定化凝胶最佳质量分数为9%,最适湿细胞包埋量为0.28g/mL,固定化JS-02细胞酶活回收率为75%,连续反应6批后,固定化细胞活力为初始活力的86%.固定化细胞的最适pH为9.0,最适温度为50℃,固定化细胞的储存稳定性及操作稳定性高于游离细胞.     

多孔陶瓷和浮石载体固定化重组大肠杆菌表达β-葡聚糖酶

分别以多孔陶瓷和浮石为载体吸附法固定重组大肠杆菌(Escherichia coli JM 109-pLF3)表达β-葡聚糖酶.研究了载体量、转速、温度、pH等条件对固定化细胞产酶的影响.结果表明,以多孔陶瓷和浮石为载体固定化细胞发酵可以大大提高产酶效率,二者均可有效吸附重组大肠杆菌,发酵液的酶活分别达到97 U/mL和73 U/mL,比悬浮液体发酵提高了2~3倍;载体量、转速、温度对产酶的影响较大,多孔陶瓷和浮石的最佳装载量分别为20 g/100 mL培养基和8g/100 mL培养基,最佳转速为200 r/min,最佳培养温度为37℃;发酵液pH值对细胞产酶的影响较小,pH值6.0~8.0之间发酵液的酶活力变化不大.重复批次发酵结果表明,固定化发酵具有良好的重复使用能力,在连续10批次实验中,多孔陶瓷载体和浮石载体固定化发酵的酶活力分别不低于91 U/mL和72 U/mL.     

腐牛乳中产β-半乳糖苷酶酵母菌菌株的分离和筛选以及该酶的提纯与固定化

从腐牛乳中分离筛选出一产β-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.23)酵母菌菌株(No.47).摇瓶发酵获酵母细胞,利用甲笨-自溶法破碎细胞,抽提的β-半乳糖苷酶通过2次丙酮沉淀,DEAE-纤维素(DE52)柱层析、羟基磷灰石柱层析进行纯化。该酶仅以一种分子形式存在。巯基与酶的活性中心有关。此酶对金属离子敏感,能被多种金属离子及SDS、Urea、EDTA等抑制。纯化的酶固定在戊二醛交联的明胶颗粒上,残活力为14%。固定化酶最适pH为6.6,而自然酶最适pH为6.4;固定化酶与自然酶最适温度均为45℃;固定化酶pH稳定范围为6.8-9.2,自然酶为6.4-9.2,自然酶为6.4—8.0;固定化酶热稳定性优于自然酶;以邻硝基苯酚-β-D-吡喃型半乳糖苷(简称ONPG)为底物,固定化酶表观米氏常数为3.4mmol·dm~(-3),自然酶米氏常数为2.5mmol·dm~(-3)。     

谷氨酸生产菌T6—13谷氨酸脱氢酶特性研究

本文对谷氨酸生产菌Te_(-13)谷氨酸脱氢酶的辅酶专一性、热稳定性、最适温度、最适pH、动力学参数和发酵过程中酶活力变化进行了研究。结果表明该酶属胞内酶,以NADP~+为专一性辅酶,脱氨反应的最适pH为9.5,酶的最适温度为35～40℃,酶的热稳定性试验表明50℃保温10分钟,残留活力为50%,60℃保温10分钟残留活力为4%,70℃下则完全丧失活力,对L—谷氨酸和NADP~+动力学参数分别为2.13×10.2mol/L和6.58×10~(-5)mol/L,AMP、ADP对脱氨反应有激活作用,ATP无影响。     

谷氨酸酶电极的研制

将产生谷氨酸脱羧酶(GDC)的大肠杆菌菌株(E,Coli.,AS.505),在37℃培养,所得细胞经抽提得到GDC粗品,将它固定于海藻酸钠上,配合CO_2选择性电极,制得谷氨酸酶电极。它具有下列特性:(1)电极对谷氨酸的线性响应浓度范围是1.0×10~(-3)—0.5tmol/L(8.3—6300mg)谷氨酸/L;(2)电极动态响应时间1分钟,即可达约90%响应值,静态响应时间约10分钟;(3)电极连续测定六十次以上仍有响应;(4)除L-赖氨酸及L-谷氨酰胺外,其余氨基酸均不干扰电极对谷氨酸的测定;(5)电极具较高的重演性。