高分子聚合物对两种细胞转染效率的研究

比较纳米材料和阳离子多聚物转染试剂携带增强绿色荧光蛋白基因对C2C12细胞和DF-1细胞的转染效率,筛选适合的基因载体。采用Entranster TM-D纳米材料和3种阳离子多聚物(Superfect、Fect、Neofect)转染试剂介导p CDH-EGFP-puro质粒分别转染C2C12细胞和DF-1细胞,24 h后用实时荧光定量核酸扩增检测系统检测转染细胞中增强绿色荧光蛋白基因的mRNA表达水平,48 h后观察并计数阳性细胞率。结果发现4种试剂分别转染的两种细胞中均有增强绿色荧光蛋白基因的表达。C2C12细胞用阳离子多聚物转染的效率略高于纳米材料转染,其中Superfect的转染效率可达到30%;DF-1细胞用纳米材料和阳离子多聚物转染的效率都高,其中Fect的转染效率达到50%。因此,阳离子多聚物Superfect用于C2C12细胞的体外转染,Fect转染试剂用于DF-1细胞的体外转染,都表现出较高效的转染效率     

野生型人DNA polβ高表达中国仓鼠卵巢细胞系的建立及其生物学特征

脂质体转染法将野生型人DNA聚合酶beta(polβ)重组绿色荧光蛋白表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞系(CHO),经G418筛选得到稳定高表达人野生型polβ的CHO细胞.通过RT-PCR方法检测转染细胞polβmRNA的表达水平,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂实验测细胞恶性增殖能力,6-TG实验测细胞自发突变率,以探讨转染细胞的生物学特性.结果显示,转染细胞polβ的mRNA的表达较空载体转染细胞、对照细胞增加,细胞周期多被阻滞在S期,细胞软琼脂集落形成率增高,自发突变率增加,表明polβ的过表达与细胞周期的分布、细胞恶性增殖程度、遗传稳定性相关.     

脐血间充质干细胞在大鼠损伤肝脏迁徙途径的实验

目的:建立慢病毒载体转染增强型绿色荧光蛋白基因至人脐血间充质干细胞的实验体系,观察绿色荧光蛋白标记的人脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠模型肝脏局部的迁徙途径.方法:采集新鲜人脐血,梯度离心及低血清培养基体外分离、培养人脐血间充质干细胞,以慢病毒为载体转染绿色荧光蛋白基因至人脐血间充质干细胞.CCl4橄榄油溶液腹腔注射建立急性肝坏死大鼠模型,将2.0～5.0×106绿色荧光蛋白标记的人脐血间充质干细胞肝脏局部移植给模型鼠,24、48、72 h、1周、2周和4周分别处死模型鼠,冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞在肝脏局部的迁徙途径.结果:转染细胞荧光显微镜下呈现均一绿色荧光影像.细胞移植24 h内可见荧光信号由进针孔迁徙至汇管区,移植治疗48 h时移植细胞定居于汇管区,48 h后荧光信号向坏死病灶区域迁徙,1周后在肝脏坏死局部区域可见稳定的荧光信号.结论:本实验构建的绿色荧光蛋白转染人脐血间充质干细胞示踪体系稳定表达绿色荧光蛋白.经动物实验证明人脐血间充质干细胞肝脏局部移植给肝坏死大鼠模型后在肝脏局部经历了"进针孔至汇管区","汇管区至病灶区"的二次迁徙模式.     

磷酸钙法将MMP-2，MMP-3双基因干扰载体转入HEK293T细胞的效率观察

检测用磷酸钙法能否将修饰后用于沉默MMP-2,MMP-3基因的慢病毒载体有效地转入到HEK293T细胞。利用磷酸钙法,MMP-2,MMP-3双基因干扰载体（MMP组）与对照质粒（对照组）被分别转染HEK293T细胞,在转染后的第24,48及72h,通过计算绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数的百分比来判断转染效率。转染24h后,两组细胞均生长状况良好,荧光显微镜下观察,已有大量绿色荧光出现,计算MMP组转染效率为（91．5±6．2）％,对照组转染效率为（80．3±4．7）％;转染后48—72h,两组感染效率均未见明显下降。与对照相比,插入了MMP-2,MMP-3 shRNA模板序列的慢病毒载体没有降低磷酸钙法转染HEK293T细胞效率,反而有所增高。     

pEGFP-Egr-1表达质粒构建及其表达抑制HepG2细胞增殖

将RT-PCR扩增的Egr-1基因连接到pMD-18载体上并测序鉴定,经测序正确的Egr-1基因亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上构建成重组质粒pEGFP-Egr-1.重组质粒pEGFP-Egr-1转染HepG2细胞后,运用荧光显微镜及荧光定量PCR技术分析其在HepG2细胞中的表达情况,并进一步运用WST-1法分析其表达对HepG2细胞增殖的影响.结果显示,重组质粒pEGFP-Egr-1构建正确,转染后在荧光显微镜下观察可见HepG2细胞发出绿色荧光信号,荧光定量PCR分析发现转染后HepG2细胞Egr-1基因mRNA水平明显升高.WST-1结果表明,与对照组相比,转染pEGFP-Egr-1质粒的HepG2细胞,其增殖速率明显下降.上述结果表明,pEGFP-Egr-1重组质粒构建成功,外来过表达Egr-1基因能够抑制HepG2细胞增殖.     

斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的构建及对胆固醇的吸收

构建pcDNA5/FRT-SlSCP-2和阳性对照pcDNA5/FRT-GFP真核表达载体,将斜纹夜蛾固醇转运蛋白SlSCP-2和绿色荧光蛋白GFP分别整合进入Flp-In~(TM)CHO细胞基因组中的FRT位点上,利用western blotting方法和荧光倒置显微镜观察鉴定SlSCP-2和GFP蛋白在CHO细胞的表达情况.结果表明,重组质粒瞬时转染CHO细胞24h后,pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP均能正确表达目的蛋白,SlSCP-2能够增加细胞对胆固醇的吸收.同时确定了筛选稳定转染细胞株合适的潮霉素浓度.     

绿色荧光蛋白基因在牦牛乳腺上皮细胞中表达的研究

从牦牛乳腺采集组织, 并通过胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法相结合在体外成功分离、纯化到了牦牛乳腺上皮细胞. 通过观察, 具有明显的上皮细胞特征, 而且符合一般细胞的生长规律. 通过脂质体介导法将携带有绿色荧光蛋白的外源基因转染进乳腺上皮细胞中, 在荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白基因的表达.     

慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响

运用慢病毒(Lentivirus)载体构建绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的转染体系,检测转染后MSCs的表型和增殖能力,并诱导其向成肌细胞分化,检测此转染体系对MSCs细胞表型、增殖和分化能力的影响.骨髓细胞悬液破红后贴壁法培养MSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面标记,鉴定MSCs纯度;Lentivirus-GFP以1、10、50和100的感染复数(MOI)转染MSCs,作用48h后流式细胞术及免疫荧光法检测转染效率和表达的荧光强度;MTT法检测转染后MSCs的细胞活力.诱导MSCs-GFP向成肌细胞分化,蛋白印记法(WB)检测成肌细胞特异性蛋白desmin和α-SMA的表达.流式细胞术检测结果显示,培养的MSCs表达CD44、CD90和CD105,不表达CD34、CD45和CD188,符合干细胞特性.MOI为1、10、50和100的转染效率分别为23.45%、93.51%、95.44%和95.55%,MOI为10时,转染效率较高,且对MSCs活力无明显影响.MSCs-GFP体外经成肌细胞诱导分化后,表达特异性抗原desmin和α-SMA.表明本研究成功构建了小鼠骨髓来源MSCs的Lentivirus-GFP转染体系,有效标记了MSCs细胞,且此标记对MSCs的表型、增殖和分化能力等细胞生物学特性无明显影响.     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白稳定表达细胞系的建立

建立了能够稳定表达结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白的P815细胞系。将Ag85B和ESAT6基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3,构建了Ag85B—ESAT6融合蛋白的真核表达质粒Ag85B-pcDNA3-ESAT6。在阳离子聚合物作用下,重组质粒转染与BALB／c遗传背景一致的P815（H-2^4）细胞。通过G418压力筛选后,得到1株阳性克隆细胞。经过RT-PCR检测到该细胞中有Ag85B-ESAT6融合蛋白mRNA表达,用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的P815细胞膜上检测到较强的绿色荧光,证实P815细胞内有融合蛋白的表达。获得表达Ag85B-ESAT6融合蛋白的稳定细胞系。     

胃癌下调新基因GDDR表达特性及功能研究

明确胃癌下调新基因GDDR的亚细胞定位、分泌特性及生物学功能研究.与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达明确GDDR表达产物亚细胞定位;GES细胞系转染上清检测分泌蛋白表达;胃癌7901细胞系稳定转染GDDR,观察其生物学作用.发现GDDR表达产物定位于胞浆,是一分泌蛋白.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT assay)检测描绘生长曲线及流式细胞计数仪(FACS)细胞周期检测表明,GDDR对胃癌7901细胞增值显著抑制(96 h(1.233±0.017) vs (0.618±0.015), t =2.447, P =2.63×10-9),并且可以引起细胞的周期阻滞.说明胃癌下调新基因GDDR产物为胞浆分布,具有分泌特性,能通过阻滞细胞周期显著抑制胃癌细胞生长,可能为新的候选抑癌基因.     

基于基因表达谱芯片杂交分析Lamprey-PHB2转染前后Chang liver细胞的基因表达差异

选取了10个物种与本课题组前期克隆得到的东北七鳃鳗抗增殖蛋白2(Lm-PHB2)进行氨基酸序列相似性对比,检测PHB2基因进化水平,结果表明各物种的PHB2氨基酸序列在PHB结构域处高度保守,但在N-端和C-端氨基酸序列保守性较低.将重组质粒pEGFP-N1-Lm-PHB2瞬时转染入张氏肝(CHL)细胞后,利用基因表达谱芯片技术分析基因的表达差异.结果显示CHL细胞中共有270条显著差异表达基因,其中显著上调基因共141条,显著下调基因共129条,涉及细胞信号转导、细胞周期调节、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等多个方面.通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)对基因表达谱芯片分析结果进行验证,结果显示转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后,细胞周期基因CDC25C、氧化应激相关基因(CAT,SOD,GST)和抗细胞凋亡基因HAX1均有显著性差异.     

C-terminal domain of Chk1 regulates its subcellular location and kinase activity for DNA repair

Effector kinase Chk1 is an evolutionarily conserved protein kinase. It is a key mediator linking the mechanisms that monitor DNA integrity to components of the cell cycle engine. In this study, recombinant vectors pEGFP-C1-Chk1/C 288/C 334/C 368 were constructed and transfected into HeLa cells to study the effect of the Chk1 regulatory domain on the regulation of subcellular Chk1 location in response to DNA damage. We found that DNA damage-induced nuclear accumulation is regulated by 34 amino acids (334–368) in the C-terminal regulatory domain. Recombinant vectors pXJ41-Chk1/C 288/C 334/C 368 were co-transfected with reporter plasmid pEGFP-N2 into HeLa cells to study the repair abilities of the different human Chk1 truncation mutants. In addition, recombinant vectors were transfected into HeLa cells to study the effects of the different truncation mutants on the cell cycle. Furthermore, to study the kinase activity of the different truncation mutants, Ser216 phosphorylation of Cdc25C was studied by Western blot analysis. We found that the enzymatic activity of C 368, missing the 108 C-terminal amino acids (368–476), was higher than that of full-length Chk1, and C 368 delayed the cell cycle progression. The enzymatic activity of C 334, missing the 142 C-terminal amino acids (334–476), was equivalent to that of full-length Chk1. C 288, missing the 188 C-terminal amino acids (288–476), had almost no enzymatic activity, suggesting that the regulatory domain contains both inhibitory and regulatory elements. This study provides useful information for further research on Chk1 function.     

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

目的是构建人PSF基因真核表达载体pEGFP-N1-PSF,并在检测其在CHO细胞株中的表达情况。应用DNA重组技术和PCR方法从人宫颈癌Hela细胞中扩增PSF基因,插入pEGFP-N1真核表达载体,构建重组质粒pEGFP-N1-PSF并测序鉴定。将pEGFP-N1-PSF瞬时转染CHO细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测PSF的表达,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果 CHO细胞转染pEGFP-N1-PSF真核表达载体后,RT-PCR和Western blot实验发现,在RNA和蛋白水平有PSF的表达,在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP/PSF的表达。成功构建pEGFP-N1-PSF真核表达载体,证实其在CHO细胞中可以表达。     

羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡效应

目的探讨羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA对鼠胶质瘤C6细胞的促凋亡作用,并探讨相关机制.方法羟基磷灰石纳米粒子包被的Stat3 shRNA转染到C6胶质瘤细胞内,MTT法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术及吖啶橙染色观察细胞周期分布及凋亡情况,TUNEL染色观察细胞的凋亡及增殖情况.结果羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA转染C6细胞后,呈时间依赖性抑制C6细胞生长和增殖.通过流式细胞术检测证实:该质粒可使细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期,细胞凋亡率明显增加(P<0.05),与对照组比较差异有统计学意义;吖啶橙及TUNEL染色发现其明显促进细胞凋亡(P<0.05),与对照组比较差异有统计学意义;结论羟基磷灰石纳米粒子运载Stat3 shRNA体外可明显抑制胶质瘤C6细胞增殖,并促进其凋亡,是治疗胶质瘤较理想的方法.     

实验用小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞为核供体生产转基因克隆胚胎

目的比较不同类型体细胞对生产转基因克隆胚胎效率的影响。方法利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染到五指山小型猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞,经过G418筛选后均获得了阳性细胞株。然后分别以两种类型转基因细胞以及未转基因细胞为核供体进行体细胞核移植,比较不同类型供体细胞克隆胚胎的囊胚发育率。结果胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞克隆胚的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,8.3%vs.7.1%);转基因胎儿成纤维细胞(9.6%)和转基因骨髓间充质细胞(9.9%)克隆胚胎的囊胚发育率差异不显著(P>0.05,9.6%vs.9.9%);每一种类型供体细胞转基因与否对克隆胚的囊胚发育率无影响(P>0.05)。结论通过体细胞核移植技术,小型猪骨髓间充质细胞与胎儿成纤维细胞均可有效地生产转基因囊胚。     

反义人端粒酶催化亚单位基因转染对人结肠癌细胞恶性表型的逆转作用

利用基因重组技术,人端粒酶催化亚单位基因反向插入真核表达载体pcDNA3.0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞.该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G2M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落.说明反义hTRT基因体外导入结肠癌细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的增殖且能使其恶性表型发生逆转.     

Production of transgenic blastocyst of sheep by somatic cell cloning

Five samples from primary cultures of five sheep ovarian granulosa cells were transfected by pEGFP- N1 DNA. Five transgenic positive cell lines, each from one of the five samples above, were used as donor nuclei for somatic nucleus transfer. A total of 352 in vitro matured and enucleated sheep oocytes were fused electrically with transgenic granulosa cells and 329 reconstructed embryos were obtained after activation by Ionomycin/6-DMAP, and these embryos were cultured in SOFaaBSA medium for 7 d. The result shows that 312 embryos (94.8%) had gone through cleavage and among them 63 (19.1%) had developed to the blastocyst stage. Expression of GFP gene was detected in various stages of early embryonic development by sampling randomly. Blastocyst rates given by the four cells treated with 0.5% FCS starvation was 19.6% (55/280) and it had not shown difference significantly (P＞0.05) with the result obtained with another cell line that had not gone through serum starvation (16.3%, 8/49). This experiment indicates that sheep transgenic embryos up to the blastocyst stage can be produced effectively by the combination of gene transfection in somatic cells in culture and somatic cell cloning.     

pEGFP-N3-t-PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

目的利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物（t—PA）基因并构建一种能高效、安全表达t—PA的pEGFP—N3-t—PA真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础．方法采用高效Trizol试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA,RT—PCR获得t—PAcDNA,并将真核表达质粒pEGFP—N3和t—PA基因片段分别双酶切,将回收的pEGFP—N3大片段（4．7kb）与t—PA基因片段（1．1kb）重组．对pEGFP—N3-t—PA质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定．脂质体介导pEGFP—N3-t—PA转染成纤维细胞（NIn313）,并用RT—PCR法从mRNA水平检测t—PA的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NH 3T3细胞中的表达．结果成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t—PA基因,并构建了以pEGFP—N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t—PA．结论含t—PA基因真核表达质粒构建成功．     

透明质酸合成酶2真核表达载体的构建及表达

构建了透明质酸合成酶2真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达。利用RT-PCR法从MG63细胞总RNA中扩增,获得人透明质酸合成酶2cDNA,并克隆至真核表达载体pEGFP-N3,将经双酶切鉴定和DNA测序证实的阳性重组子命名为pEGFP-N3-HAS2。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。双酶切鉴定和DNA测序证实成功构建pEGFP-N3-HAS2真核表达载体。转染HEK293细胞后可见HAS2-EGFP融合蛋白高表达并定位于浆膜。该载体的成功构建为进一步探讨透明质酸合成酶2在治疗骨性关节炎、修复关节软骨缺损中的应用价值奠定了基础。     

HAb18G/CD147真核荧光蛋白的表达及鉴定

构建肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及缺失片段E51（第22—50位氨基酸缺失）的真核荧光蛋白表达载体,进一步研究该基因在肝细胞肝癌发生中的作用。通过PCR及Overlapping PCR的方法获得目的基因．与荧光载体pEGFP—N1双酶切、连接、转化E．coli JM109．构建含有肝癌相关抗原HAb18G／CD147全长及E51的真核荧光蛋白表达载体．并经限制性酶切及序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染COS-7细胞,进行瞬时表达;荧光显微镜观察EGFP表达,通过流式细胞术检测蛋白的表达情况,明胶酶谱法鉴定其功能。成功地构建了真核荧光蛋白表达载体pEGFP—N1／HAb18G、pEGFP—N1/E51,并经限制性酶切及序列分析证明外源基因插入正确;流式细胞术鉴定该蛋白表达正确;功能实验证实缺失片段E51不具有诱导成纤维细胞分泌MMPs的功能．结果显示HAb18G／CD147基因第22—50位氨基酸与其刺激成纤细胞分泌MMP和功能有密切关系。实验结果为HAb18G蛋白分子的生物学功能研究奠定了基础。