K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶基因的定点突变及其性能研究

针对菌株K.pneumoniae XJPD—Li高效转化生产1,3-丙二醇的特性,将其甘油脱水酶与已知报道的甘油脱水酶（U60992）的序列比对分析,根据差异位点设计了Nβ471的定点突变,利用反向PCR定点突变技术构建了甘油脱水酶（dhaBCE）的突变体质粒M1821,并在E．coli BL21（DE3）中高效表达。SDS—PAGE结果显示,诱导表达后在相对分子质量66、24、16KD出现三条特征条带,与预期结果一致。突变体M1821甘油脱水酶的比酶活为38．7U／mg,催化反应最适pH为8．0,最适温度为40℃,与未突变重组甘油脱水酶比较,最适温度降低了约5℃。     

辅酶依赖型和不依赖型甘油脱水酶的比较

实验比较源自肺炎克氏杆菌(K.pneumoniae)和丁酸梭状芽孢杆菌(C.butyricum)中的甘油脱水酶(GDHt)的辅酶依赖特性.采用生物信息学的方法,对两种酶的异同点进行分析,发现两种酶结构上相似性较低、亲缘性较远、分属于两个不同的家族.SMART数据库搜索结果表明,C.butyricum中不依赖辅酶的甘油脱水酶及其再激活酶,分别属于gly-Radical和Radical-SAM家族,多序列比对得到的一段富含半胱氨酸残基C**C**C的保守序列正是其共同特征.     

甘油脱水酶的研究进展

甘油脱水酶是微生物发酵法生产3-羟基丙醛和1,3-丙二醇过程中的关键限速酶.文中对甘油脱水酶的结构与功能、作用机制、基因工程研究等情况进行综述,探讨了甘油脱水酶的研究进展并提出一些建议.     

Klebsilla pneumoniae XJ-Li甘油脱水酶的催化反应特性

以自主筛选的Klebsilla pneumoniae XJ-Li为甘油脱水酶酶源,研究了其催化反应特性和稳定性。结果表明,甘油脱水酶的最适催化反应温度和pH分别为40℃和8．0。温度在40℃以下,pH处于6．0～8．0之间时酶的稳定性较好。在常见金属离子中,Mg2＋和Mn2＋对甘油脱水酶的催化反应具有一定促进作用,而Ca2＋、Co2＋、Fe3＋、Zn2＋和Cu2＋对其活性均有抑制作用。此酶对甘油的最高耐受反应浓度在0．15mol／L左右,对1,2一丙二醇的饱和浓度在0．3mol／L左右,以甘油和1,2-丙二醇为底物时的反应动力学常数Km值分别5．57mmol／L和8．16mmol／L。     

重组甘油脱水酶的活性鉴定

通过MBTH方法对重组甘油脱水酶活性进行检测。确定稳定的酶活检测系统．结果显示重组甘油脱水酶的活性明显高于野生菌．此外，甘油脱水酶单个亚基及亚基两两组合未检测到酶活性．这一结果将对酶活性研究具有重要的意义．     

Klebsilla pneumonia XJ-Li甘油脱水酶产酶条件研究

甘油脱水酶是生物法合成1，3-丙二醇的关键限速酶，对1，3-丙二醇的合成速度和发酵终浓度具有重要的影响。本文通过实验研究了Klebsilla pneumomae XJ-Li的基础产酶条件，结果表明：该菌株甘油脱水酶的合成与菌体的生长具有较好的偶联性，发酵8h即可达到最大产酶高峰，同时菌体生长也达到稳定期；其最适产酶条件为：温度40℃，oH值8．0，甘油浓度20g／L，氮源为6．0g／L的硫酸铵。     

甘油发酵生产1,3-丙二醇的菌种筛选

本实验室从上海地区的活性污泥中分离得到能使甘油转化产生1,3-丙二醇的细菌,经过初步筛选和GC-MS分析鉴定,得到一株转化率较高的菌株,随后对其发酵条件和培养基成分进行初步的探索,确定了较为优化的培养基配方．此菌株的甘油转化率达到47．3％．     

NADH扰动对酿酒酵母葡萄糖效应的影响

利用不同拷贝数的载体在酿酒酵母中表达还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化酶（NOX）和可替代氧化酶（AOX1），并通过线粒体定位信号减少AOX1对胞质NADH的影响，从而考察NOX和AOX1在分批发酵中对酿酒酵母葡萄糖效应的作用及其对葡萄糖生产衣康酸的影响。结果表明，高拷贝载体表达nox、aox1基因的菌株均有明显的代谢变化，高拷贝表达nox菌株能够氧化胞质NADH，培养基中甘油分泌减少43.94%，衣康酸生产不受影响。而高拷贝表达aox1的菌株存在胞质残留AOX1，会氧化胞质NADH而减少甘油积累。利用线粒体定位信号AAC2和BCS1p将AOX1进一步定位至酿酒酵母线粒体，120 h时衣康酸产量增加至116.98 mg/L。但是AOX1、AAC2-AOX1和BCS1p-AOX1表达菌株都没有明显减少分批发酵中乙醇的积累。在高糖培养基中进行分批发酵，NOX能够减少葡萄糖效应甘油的积累，而AOX1、AAC2-AOX1和BCS1p-AOX1不能减少葡萄糖效应副产物乙醇的积累。     

肺炎克雷伯氏菌3-羟基丙酸合成关键酶基因过表达与NAD~+再生的耦合

在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中超表达内源甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC,同时引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1,得到耦合3-羟基丙酸(3-HP)合成与NAD+再生的重组菌K.p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)。微氧摇瓶发酵结果显示在15h时3-HP产量达到1.45g/L,是携带空载体菌的2.39倍。分析是遗传扰动影响了底物甘油的代谢流量分配,从而提高了3-羟基丙酸的产量。     

基因工程菌Pichia pastoris连续培养的生长及抑制动力学

在同一稀释率μ（μ＝0．14h^-1）下用不同浓度的甘油流加进行连续培养,研究甘油浓度对基因工程菌毕赤酵母（Pichia pastori）生长的影响。结果表明甘油浓度对细胞生物量（DCW和WCW）、底物得率系数（Yx/s）、底物比消耗速率（qs）、呼吸熵（RQ）与二氧化碳释放率（CER）都有影响,在低甘油残留浓度（＜63．3g／L）下,甘油是激活剂,菌体生长符合Monod方程,Ks＝19．62g／L,甘油激活常数Ka＝19．45g／L;而在高甘油残留浓度（＞63．3g/L）下甘油是抑制剂,菌体生长特征符合Haldance方程,Ks＝0．014g／L,K1=156．67g／L。毕赤酵母生长的甘油抑制浓度为55．2g／L。     

Effects of Glycerol in the Refolding and Unfolding of Creatine Kinase

IntroductionProtein folding is the process by which the aminoacid sequence of a protein determines the three-dimensional conformation of the functionalprotein[1 ] . The elucidation of the molecularmechanism of protein folding from a disorderedpolypeptide chain to the specific native stateremains one of the major challenges inbiochemistry[2 ,3] ,namely,deciphering the secondhalf of the genetic code[4 ] .Molecular chaperonesplay an importantrole in protein folding in vivo aswell asin vitro.A cha…     

两种策略实现1,3-丙二醇关键酶基因的共表达

甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)是甘油歧化为1,3-丙二醇(1,3-PD)的两个关键酶。采用多顺反子重组和质粒共存两种策略,对来自克雷伯肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)的两个关键酶进行共表达。构建表达载体pET-28a-dhaB1B2B3-dhaT将两酶基因dhaB1B2B3和dhaT用SD序列相隔,在E.coli BL21(DE3)高水平共表达了GDHt 3个亚基和PDOR,表达蛋白分别约占菌体总蛋白的18%、9%、7%和9%。质粒pET-28a-dhaB1B2B3和pET-22b-dhaT共转化E.coli BL21(DE3)得到稳定的双质粒系统,48h后84%的细胞能同时含有两种质粒,GDHt 3亚基和PDOR分别约占菌体总蛋白的16%、8%、6%和14%。两种酶在两种表达方法下均显示高于原始菌株的酶活力。     

甘油保护剂对冷冻干燥保存红细胞作用的实验研究

应用甘油作红细胞冷冻干燥保存的保护剂,研究甘油对红细胞的保护机制.红细胞用不同质量分数(0,20%,40%)的甘油前处理后,冻干保存前后分别检查红细胞的相关指标.结果显示,40%甘油前处理的红细胞冻干保存效果最佳,红细胞回收率和血红蛋白回收率分别达到55.3%和63.4%;红细胞渗透脆性和超氧化物歧化酶(SOD)活力与冻干保存前无明显差别.该研究为使用甘油作红细胞冻干保存的保护剂提供了实验基础.     

油脂一步法合成脂肪腈──工艺条件对甘油回收率的影响

研究了油脂一步法制脂肪腈工艺中，甘油回收技术。选用适当的低温催化剂，在230℃~280℃，氨气流速1000L/hkg左右，采用分段冷凝回收工艺和回流萃取技术可获得浓度85%以上工业粗甘油，总收率达90%，杂质含量很少。     

克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇代谢途径中的酶活变化

考察了不同条件下克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella.pneumoniae)合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的3种关键酶(甘油脱氢酶(GDH)、1,3-PD氧化还原酶(PDOR)及甘油脱水酶(GDHz))的表观酶活变化。结果显示:这3种酶的酶活变化与Klebsiella.pneumoniae的1,3-PD代谢不完全相关。用SDS-PAGE电泳分析上述不同发酵条件下酶活变化,结果显示不同于3种酶的蛋白条带,Mr约为4.0×104位置的蛋白条带有明显的变化,这可能与菌体代谢过程相关,结论有待进一步深入研究。     

耐高渗压酵母的甘油发酵研究:ⅡGW-11菌株的发酵条件试验

甘油是国防和民用工业的一种重要原料,日前市场供需矛盾突出。耐高渗酵母发酵法制取甘油是解决这一供求矛盾的有希望的途径,而高产菌株选育是该途径的基础。我组1987年从广西自然环境中筛选获得一株产甘油的菌种GW-11。本文是通过对该菌株的培养基组成及培养条件的试验。以获得最佳发酵条件,并对其甘油生产性状进行考察。结果表明:优化发酵条件与原试验条件相比,该菌发酵甘油产率由原8％提高到14.0％,对糖转化率由原来的40％,提高到46.7％,GW—11是一株具有潜在工业生产价值的耐高渗的甘油发酵生产菌。     

异旋向组合转子混合性能研究

结合实验和数值模拟方法，对异旋向组合转子应用于水-甘油混合体系的混合性能进行了研究，获得水-甘油在异旋向组合转子中混合的动态画面以及甘油在混合流体中的浓度场分布图。研究结果表明，实验结果与数值模拟结果具有很好的一致性，数值模拟方法具有合理性；水-甘油流经异旋向组合转子过程中，受到转子的分割-分隔作用，使甘油的聚集状态被迅速打破；异旋向转子转动方向相反，对混合流体产生方向相反的强烈的扰动作用，促进甘油的分散；与Ll=100mm左旋转子组合的5种不同导程右旋转子中，当右旋转子的Lr=150mm时混合流体达到最好的混合均匀性。     

肿瘤细胞ECA109对甲醇等4种有机溶剂耐受剂量分析

目的通过分析一定浓度下甲醇、乙醇、丙酮和甘油作用后肿瘤细胞ECA109细胞株形态和生长状态的变化,确定上述溶剂对该细胞株的相对安全剂量。方法按照10个浓度梯度（V/V）将甲醇等4种有机溶剂加入细胞培养基,作用后的12、24、36、48 h进行细胞形态观察和生存率检测。结果 4种有机溶剂作用于ECA109细胞后都表现出不同程度的细胞毒性作用,其中,乙醇的作用最为明显,20 mL/L作用12 h就出现明显的细胞毒性,细胞形态变化明显,生存率下降显著,10 mL/L时对细胞生长基本没有影响;甲醇和丙酮也有明显作用,30 mL/L以内甲醇的作用相对缓和,而20 mL/L以后丙酮的作用则增加明显,生存率下降的同时细胞形态也出现明显改变;甘油的作用最为缓和,并且仅抑制细胞生长而对细胞形态基本没有影响。结论 ECA109细胞对4种有机溶剂的耐受性有所不同,对乙醇的耐受剂量最低,其次为丙酮和甲醇,3种溶剂不仅抑制细胞的生长,还对细胞形态产生明显影响;甘油作用较为缓和,且仅对细胞株的生长产生抑制,并不导致细胞形态改变。